FoxO3转录因子在鸡卵巢组织中的表达鉴定

【目的】明确FoxO3转录因子在不同日龄鸡卵巢组织中的表达模式及其具体定位情况,为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据。【方法】在GenBank中搜索鸡与其他物种(鸭、鹅、老鼠、猪、牛及人类)的FoxO3氨基酸序列,通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况;利用RT-PCR鉴定FoxO3基因是否在鸡卵巢组织中表达,再采用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达水平,最后以免疫荧光检测FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况。【结果】鸡与鸭和鹅的FoxO3氨基酸序列相似性分别为92.7%和95.3%,基于FoxO3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近,说明FoxO3基因的进化相对较保守。在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达,且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高,显著高于在其他发育阶段的相对表达量(P<0.05)。在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白,但在21日龄和成年鸡的卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白;在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围,在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘,小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白。【结论】由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源,且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似,说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能,即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用,因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能。

FOXO3a转录因子的研究进展

叉头框蛋白（forkhead box protein,FOX）家族是于2000年发现的一个新蛋白质家族,它在大肠杆菌及人类中均有表达,对细胞增殖、分化、机体生长发育、细胞周期、凋亡等具有重要作用。该家族包括很多亚族,其中研究最深的是O亚家族,即叉头框蛋白O（forkhead box protein O,FOXO）。目前已知FOXO家族有4个成员：

基于SIRT1/FOXO3a信号通路探讨“温阳通脉”灸法对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠炎症反应的影响

【目的】探讨“温阳通脉”灸法防治动脉粥样硬化(AS)的作用机制。【方法】将10只饲喂普通饲料的C57BL/6J小鼠设为空白组;将30只ApoE^(-/-)小鼠给予高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化模型,随机分为模型组、辛伐他汀组和艾灸组,每组10只。于造模第1天开始干预,艾灸组小鼠给予膻中、神阙、内关、血海穴艾灸,辛伐他汀组给予辛伐他汀蒸馏水混悬液灌胃,共干预12周。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察小鼠胸主动脉病理形态结构,透射电镜观察小鼠胸主动脉内皮细胞超微结构,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)水平,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测胸主动脉沉默信息调节因子1(SIRT1)和叉头框转录因子O3a(FOXO3a)的mRNA表达水平,Western Blot法检测胸主动脉SIRT1和FOXO3a蛋白表达水平。【结果】与空白组比较,模型组小鼠胸主动脉及血管内皮细胞病理变化明显,血清炎症因子TNF-α、ICAM-1和VCAM-1水平升高(P<0.05或P<0.01),胸主动脉SIRT1 mRNA和蛋白表达量降低(P<0.01),FOXO3a mRNA和蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,辛伐他汀组和艾灸组小鼠的胸主动脉及血管内皮细胞结构得到明显改善,血清TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平均降低(P<0.05),胸主动脉SIRT1 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05或P<0.01),FOXO3a mRNA和蛋白表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀组和艾灸组上述指标组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】“温阳通脉”灸法可通过调控SIRT1/FOXO3a信号通路减轻炎症反应防治小鼠AS。

鼻咽癌组织中转录因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表达及意义

目的观察鼻咽癌(NPC)组织中转录因子FOXO3a、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白及mRNA的表达,并探讨其意义。方法选择NPC患者48例,均留取NPC活检组织(NPC组);健康体检者15例,均留取正常鼻咽黏膜组织(对照组)。采用免疫组织化学方法观察两组转录因子FOXO3a、HIF-1α蛋白阳性表达,RT-PCR方法检测FOXO3a、HIF-1αmRNA相对表达量,分析FOXO3a、HIF-1α阳性表达与NPC患者临床病理参数之间的关系。结果 NPC组、对照组FOXO3a蛋白阳性表达率分别为50.0%、80.0%(P<0.05),HIF-1α蛋白阳性表达率分别为75.0%、33.3%(P<0.05)。NPC组FOXO3a mRNA、HIF-1αmRNA相对表达量分别为0.47±0.07、0.61±0.12,对照组分别为0.56±0.06、0.69±0.09;两组比较,P均>0.05。FOXO3a阳性表达与NPC患者临床分期、T分期、淋巴结转移和远处转移有关(P均<0.05),HIF-1α阳性表达与NPC患者淋巴结转移和远处转移有关(P均<0.05)。结论 NPC组织中HIF-1α蛋白阳性表达率增加、FOXO3a蛋白阳性表达率降低,二者表达变化可能与NPC的发生、发展有关。

子宫内膜癌组织叉头框转录因子O亚型3a与基质金属蛋白酶-14表达水平及相关性

目的检测子宫内膜癌中叉头框转录因子O亚型(FOXO)3a和基质金属蛋白酶(MMP)-14的表达。方法 63例行子宫内膜癌根治手术患者作为观察组,并留取术后组织,40例子宫内膜复杂性增生患者术后标本作为对照组,40例增生期子宫内膜诊刮标本作为正常对照组。采用免疫组化SP法检测3组中FOXO3a和MMP-14的表达。结果 FOXO3a和MMP-14在三组中的表达有统计学意义。观察组中FOXO3a和MMP-14的阳性率均与肌层浸润深度、淋巴结累犯密切相关,FOXO3a的阳性率与肿瘤的最大径密切相关。观察组中FOXO3a和MMP-14的表达呈负相关性。结论子宫内膜癌中FOXO3a低表达、MMP-14高表达对肿瘤的形成和进展可能有促进作用,二者具有负向协同作用。

非小细胞肺癌中FOXO3a蛋白的表达及意义

目的探讨转录因子FOXO3a在非小细胞肺癌(non-small cell carcinoma,NSCLC)组织中的表达与NSCLC发生、发展的关系及其意义。方法采用免疫组化SP法检测69例NSCLC组织中FOXO3a和CD34的表达情况。结果 (1)FOXO3a在NSCLC的表达与肿瘤组织学分级和淋巴结转移相关(P<0.05)。(2)FOXO3a在NSCLC的表达与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型、肿瘤大小均无关(P>0.05)。(3)FOXO3a与CD34在NSCLC的表达呈负相关(P<0.05)。结论 FOXO3a在NSCLC的表达情况提示FOXO3a可以限制恶性肿瘤进展及控制癌组织中微血管的形成。

FOXO3a与乳腺浸润性导管癌血管生成的相关性

目的探讨转录因子FOXO3a的表达与乳腺浸润性导管癌血管生成的相关性。方法选择该院行手术切除的乳腺浸润性导管癌组织(乳腺癌组)及相应的癌旁正常组织(癌旁组)各102例,用免疫组织化学法(免疫组化)检测FOXO3a在两组中的表达情况,用CD34标记微血管的内皮细胞,测定微血管密度(MVD),并分析FOXO3a在乳腺癌组织细胞质、细胞核的不同定位与MVD的关系。结果 (1)FOXO3a在乳腺癌中的表达(70.59%,72/102)低于癌旁组织(84.31%,86/102)(P<0.05)。FOXO3a在乳腺癌组织细胞核表达的阳性率为(15.69%,16/102),低于癌旁组织(81.37%,83/103)(P<0.05);而在细胞质表达的阳性率(63.73%,65/102)高于癌旁组(14.71%,15/102)(P<0.05);(2)乳腺癌组织中MVD的水平(27.46±5.87)高于癌旁组(17.25±3.61)(P<0.05)。乳腺癌组织细胞核FOXO3a阳性者MVD的水平(23.19±4.00)低于FOXO3a阴性者(28.24±5.84)(P<0.05);细胞质FOXO3a阳性者MVD的水平(26.39±3.12)与FOXO3a阴性者(27.90±4.37)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 FOXO3a在细胞核的表达增加可能对乳腺癌组织中微血管的生成起抑制作用。

微小RNA-708靶向调控FOXO3表达及对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨微小RNA-708(miR-708)对叉头转录因子O亚型3(FOXO3)表达的靶向调控作用及对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法采用脂质体法向NSCLC细胞A549转染miR-708抑制剂(Inhibitor组)和阴性对照(NC组),并设空白对照组。采用实时定量PCR(QPCR)检测miR-708水平以评估转染效率,分别采用MTT法、细胞划痕实验和侵袭实验检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告基因实验验证miR-708对FOXO3的靶向关系,采用QPCR检测FOXO3 mRNA水平。结果Inhibitor组的miR-708水平为0.241±0.057,低于空白对照组的1.027±0.121和NC组的1.186±0.254(P<0.05);与空白对照组和NC组相比,Inhibitor组转染后24~48 h时的细胞增殖活力降低(P<0.05);Inhibitor组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(33.24±1.98)%和(202.9±8.4)个,均低于空白对照组的(54.23±2.16)%和(352.7±12.5)个及NC组的(55.63±2.78)%和(361.2±13.7)个,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-708模拟物可抑制野生型FOXO3 3’端非翻译区的荧光素酶活性,而不影响突变型。QPCR结果显示,Inhibitor组的FOXO3 mRNA水平高于空白对照组和NC组(P<0.05)。结论下调miR-708水平可抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力,可能通过靶向FOXO3来发挥促癌作用,有望成为NSCLC防治的潜在靶点。

FoxO3腺病毒载体的构建及对脑缺血损伤中自噬相关蛋白的影响

目的:构建转录因子FoxO3的过表达腺病毒载体AV-FoxO3,包装产生高滴度腺病毒;观察其感染氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)损伤小鼠海马细胞系HT22细胞自噬相关蛋白表达的影响。方法:在Gen Bank中查询FoxO3基因及其上下游的序列,设计合成引物并在引物中引入HA序列,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)体外扩增目的基因,用限制性内切酶NheⅠ-HF和Af1Ⅱ双酶切表达载体p AdenoEF1-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG,使用无缝克隆试剂盒将目的基因构建进表达载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取转化子进行菌落PCR鉴定获得阳性克隆(FoxO3重组质粒)并测序;利用Ad Max系统在HEK293A细胞中分别包装FoxO3重组质粒与对照质粒,得到AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.并测定病毒滴度;用AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.感染HT22细胞,荧光显微镜观察感染是否成功,Western Blot检测HT22细胞中HA蛋白(重组FoxO3序列中所含的标签蛋白)的表达;Western Blot检测OGD损伤HT22细胞中自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结果:菌落PCR和测序结果均表明FoxO3重组质粒构建成功;与辅助质粒共包装感染细胞获得腺病毒颗粒,测定滴度分别为6.32×1010 Ifu/m L和4×1011Ifu/m L;荧光观察及Western Blot检测均说明AV-FoxO3成功地感染了HT22细胞;FoxO3过表达促进自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结论:AV-FoxO3构建成功并可用于HT22细胞的感染,增加细胞内FoxO3表达;FoxO3参与调控自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。

双萜化合物对FOXO3a核转位调控机制

从中国传统药用植物绣线菊中提取一种可以引起bax和bak非依赖性细胞凋亡的双萜类化合物,并将其命名为S3.前期的研究发现S3可引起bax-/-/bak-/-MEF细胞活性氧(ROS)水平显著升高,并激活FOXO3a,促进其从胞浆转位至细胞核.然而由S3介导产生的活性氧是如何激活FOXO3a转录因子的,目前仍不是很清楚.本研究发现S3诱导细胞凋亡过程中可以激活JNK、ERK信号通路,同时显著地抑制AKT的活性;而ROS的清除剂NAC有效地抑制JNK、ERK的激活,促进AKT的活化,同时抑制FOXO3a的核转位.从而证实由S3介导产生的活性氧通过调控JNK、ERK、AKT激酶的活性,进而调控FOXO3a的核转位活性.

FoxO3a转录因子在心脏老化中的研究进展

FoxO是叉头框蛋白(FOX)家族的重要成员,在细胞增殖、凋亡、代谢、应激以及长寿方面发挥重要作用。FoxO3a主要表达于心脏,在调节心脏及相关疾病的发生发展中起主要作用,而成为研究的热点。本综述讨论FoxO3a的调控机制并聚焦其在心脏衰老过程中的最新进展。

circ-FOXO3靶向miR-761调控对非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其机制

目的研究circ-叉头转录因子O亚型(FOXO)3靶向miR-761调控对非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其机制。方法培养非小细胞肺癌细胞,分为pcDNA组、pcDNA-circ-FOXO3组、si-NC组、si-circ-FOXO3组、anti-miR-NC组、anti-miR-761组、pcDNA-circ-FOXO3+miR-NC组、pcDNA-circ-FOXO3+miR-761组,另将正常培养的NCI-H1299细胞记为NC组。实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞circ-FOXO3和miR-761表达水平;细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western印迹法检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cleaved-胱天蛋白酶(caspase)-3蛋白表达;验证circ-FOXO3和miR-761的靶向关系。结果过表达circ-FOXO3或抑制miR-761可降低NCI-H1299细胞增殖活力,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。上调miR-761可减弱circ-FOXO3过表达对NCI-H1299细胞的作用。结论过表达circ-FOXO3可能通过靶向下调miR-761,抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。

妊娠期糖尿病孕妇血清和胎盘组织中FOXO3a的表达水平及其与胰岛素抵抗的关系

目的探讨妊娠期糖尿病(GDM)孕妇血清和胎盘组织中转录因子FOXO3a表达水平及其与胰岛素抵抗之间的相关性,旨在为临床诊断及治疗GDM提供胰岛素抵抗相关新靶点。方法选取2016年1月-2017年1月在陕西省人民医院定期产检并住院分娩的52例GDM孕妇为研究对象(GDM组),另选取同期在该院分娩的52例正常孕妇作为正常组。检测两组孕妇产前体质量指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及空腹胰岛素(FINS),应用胰岛素稳态模型评估法(HOMA)计算胰岛素分泌指数(HOMA-β)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(HOMA-ISI),应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清中FOXO3a表达水平,应用免疫组织化学法(SP)检测胎盘组织中FOXO3a蛋白表达水平。结果两组年龄、孕周、收缩压、舒张压比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),GDM组产前BMI明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。GDM组FINS、FPG、2hPG、TG、TC、HOMA-IR明显高于正常组,HOMA-β、HOMA-ISI明显低于正常组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。GDM组血清FOXO3a mRNA表达水平明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);GDM组胎盘组织中FOXO3a蛋白表达阳性率明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。GDM组血清FOXO3a表达与FINS、HOMA-IR呈明显正相关关系(P<0.05),GDM组胎盘组织中FOXO3a蛋白表达与HOMA-IR呈明显正相关关系(P<0.05)。HOMA-IR是GDM组血清及胎盘组织中FOXO3a表达的独立影响因素(P<0.05)。结论FOXO3a在GDM血清及胎盘组织中均呈显著高表达,可能是GDM胰岛素抵抗发病机制之一。

麦冬提取物对胰岛素抵抗大鼠肝组织miRNA-29a及FOXO3表达的影响

目的：探讨麦冬提取物对胰岛素抵抗大鼠肝组织中miRNA-29a及FOXO3表达的影响。方法：选取60只SD级雄性大鼠,随机选取10只为正常组,其余50只建立胰岛素抵抗大鼠模型,造模成功后分为模型组、麦冬提取物高、中、低剂量组、二甲双胍组5组,每组10只,麦冬提取物高、中、低剂量组分别给予150,300,500 mg·kg^-1麦冬提取物灌胃给药干预,二甲双胍组给予200 mg·kg^-1二甲双胍混悬液灌胃给药干预,正常组及模型组给予等体积的生理盐水,分别于给药4,8周后,检测各组大鼠体重（BW）,肝重（LW）,空腹血糖（FBG）,血清总胆固醇（TC）,甘油三酯（TG）,空腹胰岛素（FINs）,胰岛素敏感指数（ISI）,肝脏指数（LI）,C肽;苏木素-伊红（HE）染色观察肝脏病理变化;采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测肝组织miRNA-29a,FOXO3表达水平。结果：正常组大鼠饮食正常,皮毛整洁,精神状态良好,模型组大鼠精神萎靡、皮毛凌乱欠光泽,懒惰,麦冬提取物组及二甲双胍组大鼠皮毛欠光泽,有不同程度活动及饮食减少,精神状态优于模型组;麦冬提取物可明显降低胰岛素抵抗大鼠BW,LW,LI,C肽水平（P〈0.05）,明显降低TC,TG,FINs水平（P〈0.05）,显著升高ISI水平（P〈0.05）,改善大鼠胰岛素抵抗;麦冬提取物明显改善胰岛素抵抗模型大鼠脂肪变性,改善肝脏病理状态;麦冬提取物可明显下调miRNA-29a表达,上调FOXO3表达,且呈现一定剂量依赖性（P〈0.05）。结论：麦冬提取物可明显改善胰岛素抵抗,推测其机制为下调miRNA-29a表达,上调FOXO3表达。

降脂通络软胶囊调控SIRT1/FoxO3通路对膜性肾病大鼠细胞凋亡的影响

目的:通过观察降脂通络软胶囊对膜性肾病(MN)大鼠肾组织中沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/叉头转录因子O3(FoxO3)蛋白表达及足细胞凋亡的影响,探讨其治疗MN的可能分子机制。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为6组,每组10只,随机选取1组作为正常组,其余5组分别为模型组、盐酸贝那普利(西药)组(10 mg·kg^(-1))和降脂通络软胶囊低、中、高剂量(中药低、中、高剂量)组(25、50、100 mg·kg^(-1)),并通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法造模。造模成功后,各组按照相应比例剂量连续4周灌胃给药,并在第4周末留取肾组织,采用电镜、免疫荧光观察肾脏病理学变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾脏SIRT1、FoxO3蛋白的表达情况,免疫组化(IHC)检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、死亡启动子重组蛋白(Bad)、足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)、膜蛋白(Podocin)的蛋白表达情况。结果:与正常组比较,模型组大鼠肾组织中促凋亡因子Bax、Bad、FoxO3蛋白表达均明显增加(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2、SIRT1、Nephrin、Podocin蛋白表达均降低(P<0.05);与模型组比较,各治疗组肾组织中Bax、Bad、FoxO3蛋白表达明显减少(P<0.05),Bcl-2、SIRT1、Nephrin、Podocin表达明显升高(P<0.05)。结论:降脂通络软胶囊对MN的肾保护作用可能与其调控SIRT1/FoxO3通路,减少足细胞凋亡,维护足细胞结构稳定有关。

AMPK活化对大鼠骨骼肌Akt/FoxO磷酸化介导的泛素蛋白连接酶mRNA表达的影响

目的:采用一次性AICAR注射动物模型,观察AMPK活性变化对Akt、FoxO磷酸化的影响,探讨骨骼肌蛋白质的降解机制。方法:采用同位素技术测定腓肠肌中AMPK活性变化;采用Western blot方法,测定腓肠肌中Akt/FoxO3a总蛋白含量及其磷酸化变化;采用实时荧光定量PCR方法,测定腓肠肌MAFbx mRNA和MuRF-1 mRNA基因表达。结果:AICAR注射后1、2、7 h,AMPK活性与对照组相比升高(P<0.05或P<0.01);AICAR注射后1、2、7 h,Akt磷酸化水平下降(P<0.05或P<0.01),分别是对照组的0.26倍、0.42倍、0.85倍;AICAR注射后1、2 h,FoxO3a磷酸化水平降低(P<0.05),分别是对照组的0.32倍、0.41倍;与对照组相比,AICAR注射后1、2 h,MuRF-1 mRNA和MAFbx mRNA表达量升高(P<0.01),AICAR注射后7 h,MuRF-1 mRNA表达量升高(P<0.05)。结论:AMPK在细胞内可能调节多条信号通路,多种蛋白质降解途径,通过降低Akt磷酸化,活化FoxO,促进泛素蛋白连接酶的表达,降解骨骼肌蛋白质是其中一条途径。