关岭牛FoxO6基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

应用RT-PCR克隆关岭牛FoxO6基因的CDS区,构建重组表达载体并对该基因进行相关生物信息学分析。获得关岭牛FoxO6基因CDS区,成功构建p ET-32a(+)-FoxO6重组表达载体。FoxO6基因编码区为942 bp,编码313个氨基酸,表达蛋白大小为33.60 ku;该蛋白为亲水性蛋白,等电点p I=9.44,在体内带正电,二级结构中主要是无规卷曲和α-螺旋;蛋白没有信号肽和明显的跨膜区,为胞内蛋白,主要存在于细胞核中。重组载体表达的FoxO6蛋白带有His等标签,蛋白大小为53.0 ku,共492个氨基酸。试验对关岭牛FoxO6蛋白的理化性质、结构特点进行了初步分析,为研究牛FoxO6蛋白功能及其作用机制奠定理论基础。

FOXO转录因子亚家族在瘢痕疙瘩中的表达及意义初探

目的检测人类叉头框O(FOXO)转录因子亚家族(FOXO1、FOXO3a、FOXO4、FOXO6)在人瘢痕疙瘩组织中的表达,为下一步探讨FOXO转录因子亚家族对瘢痕疙瘩生物学活性的影响提供实验依据。方法通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法以及免疫组织化学染色法检测FOXO转录因子亚家族中FOXO1、FOXO3a、FOXO4、FOXO6在人瘢痕疙瘩组织中的表达情况。结果实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法以及免疫组织化学染色法均证实与正常皮肤组织相比FOXO1、FOXO3a、FOXO4在瘢痕疙瘩组织中的表达均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),FOXO6的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论瘢痕疙瘩中显著低表达的FOXO1、FOXO3a、FOXO4可能对瘢痕疙瘩的生物学活性有影响。

叉头转录因子O亚族6对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力的作用

目的探讨叉头转录因子O亚族6(FoxO6)对结肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其分子机制。方法将FoxO6 siRNA转染结直肠癌细胞HCT116和SW480,干扰FoxO6表达。构建过表达载体pcDNA.3.1-c-Myc,转染FoxO6沉默的HCT116和SW480细胞,过表达c-Myc。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot法检测HCT116和SW480细胞中FoxO6、c-Myc、p21的mRNA和蛋白表达量,溴脱氧尿苷(BrdU)法检测细胞增殖能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。将FoxO6 shRNA慢病毒(LV-FoxO6)转染的SW480细胞注射至BAL b/c裸鼠右侧腋窝皮下构建荷瘤模型,注射后第10、13、16、19、22、25天测量瘤体体积。结果正常结肠细胞FHC、结肠癌细胞系HCT116和SW480中FoxO6的mRNA表达水平分别为0.91±0.04、1.72±0.07和2.03±0.06,蛋白表达水平分别为0.7±0.04、1.35±0.08和1.56±0.07,结肠癌细胞系HCT116和SW480中FoxO6的mRNA和蛋白表达水平均高于FHC细胞(均P<0.05)。转染FoxO6 siRNA后,HCT116和SW480细胞中FoxO6 mRNA和蛋白表达均降低(均P<0.05),细胞增殖能力降低(吸光度分别为0.26±0.07和0.27±0.06,均P<0.05),侵袭能力下降[侵袭细胞数分别为(42.3±3.3)个和(45.7±4.1)个,均P<0.05],c-Myc的mRNA和蛋白表达量降低(均P<0.01),p21的mRNA和蛋白表达量升高(均P<0.01)。转染pcDNA.3.1-c-Myc到FoxO6沉默的HCT116和SW480细胞后,p21表达量减少,细胞增殖能力增强(吸光度分别为0.54±0.09和0.58±0.07,均P<0.01),侵袭能力增强[侵袭细胞数分别为(79.2±5.9)个和(80.5±6.4)个,均P<0.01]。裸鼠接种细胞后第25天,LV-FoxO6-SW480组的肿瘤体积为(190.6±36.2)mm^3,明显低于SW480组[(437.8.6±69.2)mm3,P<0.05]。结论FoxO6可通过c-Myc调节p21的表达,进而调控结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力。