IL-17和Foxp3在小鼠克罗恩病模型中的表达及其意义

目的观察小鼠克罗恩病模型外周血单核细胞及结肠组织中白细胞介素（IL）17、叉头状/翅状螺旋蛋白3（Foxp3）的表达,探讨其在2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的克罗恩病小鼠急性炎症中的作用。方法共40只6~8周龄雌性Bal/c小鼠,采用随机数字表法随机分为两组,20只以TNBS/乙醇溶液灌肠诱导克罗恩病模型（实验组）,另外20只小鼠以同等浓度的乙醇氯化钠灌肠（正常对照组）。干预1周后行疾病活动指数（DAI）,结肠病理组织学评分（TDI）和结肠大体形态损伤指数（CMDI）评价,以实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测小鼠外周血单核细胞IL-17mRNA、Foxp3 mRNA的表达,采用免疫印迹法检测小鼠结肠组织IL-17蛋白、Foxp3蛋白的表达。结果与正常对照组相比,实验组的DAI、TDI、CMDI显著升高[DAI（5.41±0.48）比（0.85±0.07）,TDI（5.63±0.74）比（0.74±0.08）,CMDI（6.88±0.84）比（0.91±0.06）,P〈0.01],外周血单核细胞的IL-17 mRNA显著升高[（1.118±0.145）比（1.000±0.000）,P〈0.01],与其DAI、TDI及CMDI呈正相关（r=0.875,0.935,0.825,P〈0.01）,Foxp3 mRNA显著降低[（0.797±0.271）比（1.000±0.000）,P〈0.01],与其DAI、TDI及CMDI呈负相关（r=-0.885,-0.734,r-0.812,P〈0.01）,结肠组织IL-17蛋白显著上升[（0.631±0.331）比（0.272±0.112）,P〈0.01],与其DAI、TDI及CMDI呈正相关（r=0.765,0.778,0.734,P〈0.01）,Foxp3蛋白显著降低[（0.274±0.112）比（0.592±0212）,P〈0.01],与DAI、TDI及CMDI呈负相关（r=-0.889,-0.809,-0.851,P〈0.01）。结论在TNBS诱导的结肠炎中,Th17/Treg轴的免疫偏倚是导致克罗恩病发生和发展的重要因素。

Foxp3在AOM/DSS诱导小鼠结肠癌模型中的表达及其意义

目的观察头状/翅状螺旋蛋白3(FOXP3)在氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导小鼠结肠癌中的表达水平及其意义。方法将雌性SPF级C57BL/6小鼠随机分为两组:对照组10只;AOM/DSS组(模型组)10只。模型组小鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg),饮用1%DSS 1周,之后正常饮水2周,以上为1个周期,连续3个周期;对照组以等体积生理盐水腹腔注射,并正常饮水。于实验11周末处死所有小鼠。结肠病理组织HE染色观察病理组织学改变。收集血浆,血细胞分析仪检测单核细胞计数;留取结肠癌组织,免疫组织化学染色方法检测Foxp3蛋白表达水平。结果结肠组织行HE染色后发现模型组小鼠均出现不同程度的结肠癌表现。模型组血浆单核细胞计数明显低于正常组[(5.14±0.25)×10~9/L vs(5.78±0.17)×10~9/L,P<0.01],免疫组化染色半定量分析结肠癌组织中Foxp3蛋白表达水平较正常对照组显著升高(3.55±0.88 vs 1.00±0.71,P<0.05)。结论在AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌中,Foxp3蛋白表达增加促进了其发生发展。

上调Foxp3抑制卵巢癌细胞Skov3侵袭和迁移及其机制的研究

目的:探讨Foxp3基因对卵巢癌细胞Skov3侵袭与迁移的影响及作用机制。方法:构建Foxp3基因过表达质粒,采用脂质体转染导入Skov3细胞;以空载体转染细胞株为对照,通过细胞增殖、侵袭、RT-PCR和Western blot实验,观察Skov3细胞Foxp3基因的表达情况,以及过表达Foxp3后细胞的侵袭与转移能力变化,检测MMP-2以及MMP-9基因表达变化。结果:导入过表达Foxp3质粒后,Skov3细胞的Foxp3表达显著升高;与空载体相比,过表达Foxp3基因显著抑制Skov3细胞的侵袭和迁移能力,并显著降低MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。结论:上调Fox P3基因表达能通过下调MMP-2和MMP-9基因表达抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移行为,为深入研究Foxp3基因在体内的抑瘤作用和卵巢癌的基因治疗提供实验依据。

豚鼠肺气肿模型肺组织Foxp_3、RORγt及IL-17的表达及意义

目的采用弹性蛋白主动免疫方法制造豚鼠肺气肿模型,与传统熏烟制造模型方法比较,探究弹性蛋白抗体对肺气肿的影响;探讨豚鼠肺气肿模型肺组织中叉头状/翅状螺旋蛋白3(Foxp3)、维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)、白细胞介素17(IL-17)的表达和意义。方法分别采用熏烟、弹性蛋白主动免疫的方法制造豚鼠肺气肿模型;测量各组模型中肺泡平均半径;免疫组化技术检测肺组织Foxp3、RORγt和IL-17。结果熏烟组及主动免疫组平均肺泡半径明显长于对照组(P<0.05)。熏烟组及主动免疫组较对照组肺组织中Foxp3阳性细胞数减少,RORγt阳性细胞增多,Foxp3/RORγt比值表达失衡,IL-17表达水平增强(P<0.05),熏烟组与主动免疫组比较差异无统计学意义。相关性分析提示豚鼠肺组织Foxp3/RORγt阳性细胞比值与IL-17及平均肺泡半径呈负相关(P<0.05)。结论弹性蛋白主动免疫可以导致豚鼠肺气肿发生;熏烟组及主动免疫组豚鼠肺气肿模型肺组织中存在Foxp3/RORγt表达失衡,这种失衡可能是免疫调节细胞CD4+T细胞及效应细胞Th17细胞表达失调的重要机制,从而可能参与慢性阻塞性肺疾病(COPD)自身免疫调节,对COPD的发生发展有一定的促进作用。

继发性肺结核患者治疗初期FOXP3 TSDR DNA去甲基化变化情况分析

目的应用一种 FOXP3 TSDR DNA去甲基化荧光定量PCR技术，并分析该方法在继发性肺结核患者治疗初期变化情况。方法选取2014年6月～2015年5月来深圳市龙华新区慢性病防治中心就诊的继发性肺结核病人47例作为研究组，健康对照40例，分离外周血单个核细胞，筛选 CD4＋CD25＋T细胞，提取基因组 DNA。利用去甲基化 FOXP3 TSDR特异性引物扩增对照组基因组DNA，通过酶切、克隆和回收纯化等过程构建质粒标准品，优化 FOXP3 TSDR去甲基化实时定量PCR技术，建立CD4＋CD25＋T细胞比例与 FOXP3 TSDR PCR 拷贝换算关系，用该方法分析对照组和研究组0周及治疗后2，4和8周时的调节T细胞频率（FOXP3 TSDR去甲基化），应用 spss16.0软件统计分析实验所得数据。结果0周时47例研究组抗酸染色均为阳性，对照组均为阴性。以抗酸染色结果分组：对照组、抗酸（1＋）组、抗酸（2＋）组、抗酸（3＋）组和抗酸（4＋）组其调节 T细胞频率分别为1.63％＆#177;0.70％，1.96％＆#177;0.10％，1.32％＆#177;0.32％，0.86％＆#177;0.21％和0.53％＆#177;0.12％，抗酸（2＋）组与对照组差异无统计学意义，抗酸（3＋）组与对照组差异有统计学意义。研究组0，2，4和8周时调节T细胞频率均值、范围及95％可信区间分别为1.05％（0.32％～2.03％），CI（0.93％，1.18％）；2.04％（0.95％～3.95％），CI（1.85％，2.24％）；3.44％（2.35％～4.95％），CI（3.27％，3.61％）；2.79％，（1.02％～4.27％），CI （2.60％，2.98％）。对照组与研究组0周时人群调节T细胞频率之间差异有统计学意义（t＝4.669，P＜0.05）。单变量方差分析显示治疗时间对研究组外周血调节T细胞频率（FOXP3 TSDR 去甲基化）水平变化有影响（F＝347.2，P＜0.001， df＝3，组内F＝407.4，P＜0.001，df＝3），治疗时间和分组交互效应呈线性关系（F＝678.2，P＜0.001，df＝1）。结论该方法敏感、特异，可以用于继发性肺结核患者的疗效监测。

乳腺癌患者外周血CD_4^+CD_(25)^+细胞胞浆FoxP_3与胞膜CD_(127)的关系研究

目的:探讨人体外周血CD4+CD25+细胞胞浆FoxP3与胞膜CD127的关系,为用CD4+CD25+CD127-作为界定调节性T细胞(Treg)的标志提供依据。方法:利用三色流式细胞计数分别测定32份外周血CD4+CD25+T细胞和CD4+T细胞中CD4+CD25+CD127-细胞和CD4+CD25+FoxP3+细胞百分率,对两者作相关性研究分析。结果:人体外周血CD4+CD25+T细胞和CD4+T细胞中CD4+CD25+CD127-与CD4+CD25+FoxP3+细胞的百分率均呈正相关(r值分别为0.962和0.803,P<0.01),CD4+CD25+CD127-的检测比CD4+CD25+FoxP3+检测更简便快捷。结论:人体外周血CD4+CD25+T细胞和血CD4+T细胞中CD4+CD25+CD127-与CD4+CD25+FoxP3+细胞百分率呈正相关,CD4+CD25+CD127-可以作为界定Treg细胞的标志及其检测。

艾灸“足三里”对功能性消化不良大鼠Foxp3/ROR-γt失衡的影响

目的探讨艾灸治疗功能性消化不良(FD)的可能作用机制。方法43只大鼠随机选取10只作为空白对照组,剩余33只大鼠进行造模,将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、艾灸组、莫沙必利组,每组10只。空白对照组不予任何处置,余组均采用复合因素(夹尾刺激+不规则饮食)干预法造模20日。造模成功后,艾灸组予以艾灸"足三里",每日1次,每次30min;莫沙必利组予以莫沙必利0.45mg/(kg·d)灌胃,两组均干预14天。干预结束后采用ELISA法检测各组大鼠血清血细胞介素17(IL-17)水平,采用HE染色观察各组大鼠十二指肠形态变化,采用Western blot法检测各组大鼠十二指肠叉头状/翅状螺旋蛋白3(Foxp3)、维甲酸相关核孤儿受体-γt(ROR-γt)蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组大鼠血清IL-17水平显著升高(P<0.01);十二指肠黏膜结构较完整,但绒毛部分脱落,排列欠整齐,有炎性细胞浸润;十二指肠Foxp3蛋白表达显著降低(P<0.01),ROR-γt蛋白表达水平升高(P<0.01)。与模型组比较,艾灸组及莫沙必利组大鼠血清IL-17水平均降低(P<0.05);艾灸组及莫沙必利组大鼠十二指肠绒毛排列较模型组整齐,炎症细胞浸润减少,但莫沙必利组大鼠十二指肠绒毛部分绒毛存在破损,脱落;此二组Foxp3蛋白表达升高(P<0.05),ROR-γt蛋白表达降低(P<0.05)。与莫沙必利组比较,艾灸组大鼠血清IL-17水平降低(P<0.05);十二指肠Foxp3及ROR-γt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论艾灸"足三里"能降低FD模型大鼠血清IL-17水平,调节Foxp3/ROR-γt平衡,从而减轻肠道炎症,可能是其治疗FD的作用机制之一。