慢病毒表达载体的构建及沉默FOXQ1基因在大肠癌细胞系DLD-1中的表达

目的:构建FOXQ1基因shRNA慢病毒干扰系统,沉默FOXQ1基因在大肠癌细胞系DLD-1中的表达.方法:根据FOXQ1基因的序列,设计合成3对shRNA干扰序列,退火后连接到载体质粒PLKO.1-puro,将重组质粒转化至STBl3感受态中,涂板培养挑取单菌落,摇菌后小提质粒,选取酶切及测序鉴定正确的重组质粒去内毒素大提,将质粒与辅助包装质粒pRSV-rev、pMDlg-pRRE和pCMV-VSV-G利用磷酸钙法共转染293-T细胞,收集病毒上清,感染目的细胞DLD-1,嘌呤霉素筛选FOXQ1沉默细胞,经荧光定量PCR及Western blot检测干扰效果.结果:酶切及测序结果显示shRNA成功插入载体PLKO.1-puro中,共转染293-T细胞成功获取病毒上清,感染DLD1细胞,经嘌呤霉素筛选出FOXQ1沉默细胞,荧光定量PCR及Western blot鉴定FOXQ1基因表达最高抑制率为90.4%.结论:通过构建FOXQ1基因shRNA慢病毒干扰系统,成功获取FOXQ1基因沉默细胞.为后续FOXQ1基因在肿瘤发生发展的研究奠定实验基础.

大肠癌细胞FoxQ1与EGFR基因表达的相关性

目的探讨大肠癌细胞中FoxQ1与EGFR基因间的相关性,为研究大肠癌中FoxQ1基因在EGFR通路中的作用机制奠定基础。方法应用荧光定量PCR以293-T细胞中FoxQ1及EGFR基因相对表达量为1作为参照,检测大肠癌细胞系DLD1、HT29、LOVO、HCT116中FoxQ1及EGFR基因mRNA相对表达量;荧光定量检测经shRNA-FoxQ1慢病毒干扰后的DLD1细胞(命名为DLD1-shRNAFoxQ1)中EGFR的相对表达量改变;DLD1-shRNA-FoxQ1经EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl和siRNA-EGFR处理后,荧光定量PCR分别检测FoxQ1和EGFR基因mRNA相对表达量。结果(1)FoxQ1在DLD1、HT29、LOVO、HCT116细胞系中的相对表达量分别为83.09、59.58、0.06、0.03,EGFR的相对表达量分别为4.95、3.67、2.08、1.36;(2)经shRNA-FoxQ1干扰的DLD1细胞EGFR表达量随FoxQ1表达量的降低而增高;(3)细胞DLD1-shRNA-FoxQ1、DLD1-shRNA-Control分别经siRNA-EGFR处理抑制EGFR的表达后,FoxQ1表达量随EGFR表达量的降低而增高,经Erlotinib HC1阻断EGFR酪氨酸激酶后,FoxQ1表达量增高。结论大肠癌细胞系中FoxQ1与EGFR基因的表达趋势基本一致;同时两者间可能相互存在负反馈调节机制,从而维持大肠癌细胞中FoxQ1与EGFR高表达的状态。

SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌细胞凋亡诱导作用的实验研究

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路是否参与转录因子叉头框Q1(FOXQ1)基因诱导的胃癌细胞凋亡。方法:采用q RT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞及不同胃癌细胞系中FOXQ1的表达情况,FOXQ1 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞设为si-FOXQ1组,同时设置转染正常对照组(Normal)和阴性对照组(si-Control),q RT-PCR和Western blot检测FOXQ1基因和蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白及SHH信号通路相关蛋白SHH、Smo及下游分子Gli1和Gli3蛋白表达水平。结果:FOXQ1在胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达显著低于胃癌细胞(P<0.05),胃癌SGC-7901细胞中FOXQ1的表达最高,作为后续实验研究对象。转染FOXQ1 siRNA后SGC-7901细胞中FOXQ1的表达显著下降(P<0.05)。si-FOXQ1组凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著高于si-Control组(P<0.05),而SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达显著低于si-Control组(P<0.05)。Normal组和si-Control组间以上各指标差异无统计学意义(P>0.05)。SHH特异性激活剂purmorphamine能够逆转转染FOXQ1 siRNA诱导的SGC-7901细胞凋亡。结论:FOXQ1基因在胃癌细胞中呈高表达,SHH信号通路参与FOXQ1基因对胃癌SGC-7901细胞凋亡的诱导作用,通过上调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达来实现。

FOXQ1介导TGF-β1信号通路调控胰腺癌PANC-1细胞体外血管生成

目的:探讨沉默叉头框蛋白Q1(forkhead box Q1,FOXQ1)基因对胰腺癌PANC-1细胞体外血管生成的影响及其在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号通路中的作用。方法:用FOXQ1-sh RNA重组慢病毒和阴性对照慢病毒(NC-sh RNA)感染PANC-1细胞,流式细胞术检测感染率,实时荧光定量PCR(q PCR)和Western blotting法检测沉默效果。实验设FOXQ1-sh RNA组、NC-sh RNA组与空白对照组,用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)进行体外血管生成实验,荧光显微镜下观察细胞血管生成能力。用q PCR、Western blotting法检测VEGF-A、MMP-2 m RNA和蛋白的表达水平;用TGF-β1(终质量浓度5 ng/ml)诱导FOXQ1-sh RNA组和NC-sh RNA组细胞,检测诱导前后细胞体外血管生成能力变化与FOXQ1、VEGF-A、MMP-2表达差异。结果:sh RNA慢病毒感染率为90%左右,FOXQ1-sh RNA组PANC-1细胞的体外血管生成数目显著少于NC-sh RNA组[(9.33±2.08)vs(28.67±2.52)条,P<0.05],其VEGF-A、MMP-2表达下调(均P<0.05)。TGF-β1增强各组细胞体外血管生成能力,促进FOXQ1、VEGF-A、MMP-2 m RNA和蛋白的表达水平(均P<0.05)。结论:FOXQ1介导了胰腺癌PANC-1细胞体外血管生成,其机制可能与VEGF-A和MMP-2的下调有关,且可能受TGF-β1通路的调控。

FOXQ1基因介导了Shh诱导的SW480细胞血管生成及增殖

目的:探讨FOXQ1基因沉默对大肠癌SW480细胞血管生成及增殖能力的影响及其在Sonic hedgehog(Shh)通路中的作用。方法:以携带FOXQ1-shRNA的慢病毒载体感染SW480细胞,将细胞株分为FOXQ1-shRNA和NC-shRNA组,利用脐静脉内皮细胞系926细胞行体外血管形成实验,荧光显微镜观察2组细胞血管形成能力,MTT、倍增时间、平板克隆形成实验检测2组细胞的存活率,real-time PCR、Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)-A、基质金属蛋白酶(MMP)2和cyclin D1 mRNA和蛋白水平。利用重组Shh蛋白诱导上述2组细胞,观察诱导前后细胞存活率及血管形成能力的变化,检测上述分子的表达差异。结果:与NC-shRNA组细胞相比,FOXQ1-shRNA组细胞的体外血管形成能力降低,而存活率无明显变化,real-time PCR及Western blot显示FOXQ1基因沉默后,VEGF-A和MMP2的表达下调,cyclin D1表达无显著差异。与NC-shRNA组比较,重组Shh蛋白诱导的FOXQ1-shRNA体外血管形成能力更低,存活率无明显差异。结论:FOXQ1基因介导了大肠癌SW480细胞的血管形成能力,对存活率无明显影响,并且可能受到Shh通路调控。

pAcGFP1-N1-FOXQ1真核表达载体的构建及在大肠癌细胞系Colo-320中的表达

目的:构建人FOXQ1(homo sapiens forkhead box Q1)基因真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,并在大肠癌细胞系Colo-320中瞬时表达.方法:利用PCR方法从YR Gene装载了FOXQ1基因全长cDNA序列(NM_033260)的质粒中扩增出FOXQ1的cDNA片段,与真核表达载体pAcGFP1-N1连接,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定无误后,采用Lipofectamine 2000瞬时转染Colo-320细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、Western blot检测FOXQ1蛋白表达水平.结果:成功构建了真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,PCR、双酶切和测序鉴定结果均正确,载体能在Colo-320细胞中正确表达FOXQ1蛋白.结论:成功构建FOXQ1真核表达载体,为进一步开展体内、体外实验,研究FOXQ1基因在肿瘤发生发展中的功能奠定了实验基础.

FOXQ1敲除乳腺癌MCF7细胞株的构建及其功能初探

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在乳腺癌细胞MCF7中稳定敲除FOXQ1,并初探其在缺氧环境中的功能。方法:Cas9慢病毒感染MCF7构建工具细胞,在工具细胞中分别转染靶向3个不同靶位点的FOXQ1-crRNA+tracrRNA,用T7E1酶筛选出编辑效率高的细胞挑取单克隆细胞株;利用T7E1酶、Sanger测序和Western印迹检测FOXQ1基因的编辑和表达情况;Western印迹检测常氧/缺氧条件下细胞FOXQ1表达情况;在常氧/缺氧条件下通过划痕实验和transwell实验检测细胞迁移能力;通过METABRIC数据库分析乳腺癌中FOXQ1与HIF1A及其编码蛋白靶基因LOX、LDHA和GLUT3表达的相关性。结果:筛选出转染靶向CCCGTGCGCATCCAGGACAT序列的FOXQ1-crRNA的细胞具有最高编辑效率;T7E1酶切、Sanger测序和Western印迹结果显示稳定敲除FOXQ1的乳腺癌MCF7细胞构建成功;缺氧促进MCF7细胞FOXQ1的表达;缺氧促进MCF7的迁移能力(t=3.78,P<0.01;t=11.94,P<0.001),敲除FOXQ1后缺氧对MCF7迁移能力的促进作用被抑制(t=0.63,P=0.55;t=2.54,P=0.064)、(t=2.46,P<0.05;t=4.95,P<0.05),乳腺癌中FOXQ1与HIF1A、LOX、LDHA和GLUT3的表达均显著正相关(P<0.0001)。结论:通过CRISPR/Cas9系统成功构建了FOXQ1基因稳定敲除的乳腺癌MCF7细胞株,并发现FOXQ1介导了缺氧对MCF7细胞迁移能力的促进作用,为进一步探究乳腺癌的缺氧微环境中FOXQ1的功能及其机制奠定了基础。

叉头框Q1基因调控肿瘤发生和发展的研究进展

转录因子叉头框Q1(forkhead box Q1,FOXQ1)是叉头框超家族的成员之一,参与多种生物学过程,并在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。FOXQ1蛋白通过直接作用于靶基因的启动子或与其他转录因子相互作用间接激活靶基因的转录,并通过促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和激活多条细胞信号转导通路而影响肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。研究表明,FOXQ1基因与多种肿瘤的发生和发展显著相关,FOXQ1基因的表达水平可作为判断多种肿瘤预后的指标。本文主要综述FOXQ1基因在肿瘤发生和发展中可能的作用机制。