益气温阳方对变应性鼻炎Treg细胞FOXP3基因甲基化的影响

目的观察益气温阳方治疗变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)近期疗效及叉状头转录因子p3(forkhead boxp3,FOXP3)甲基化对益气温阳方治疗AR的免疫耐受机制的调控作用。方法60例AR患者在知情同意原则基础上按照随机数字表法分为中药组(益气温阳方)和西药组(氯雷他定)各30例,分别于治疗前后观察病情变化情况,采集血标本,用Western blotting检测FOXP3蛋白和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMT),用亚硫酸氢钠测序法(BSP)检测FOXP3基因甲基化水平及位点。结果中药组与西药组疗效比较,中药组优于西药组(P<0.05);AR患者血中的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b浓度明显高于正常人水平(P<0.0001),而FOXP3值明显低于正常人水平(P<0.0001)。益气温阳方治疗后DNMT1、DNMT3a和DNMT3b浓度明显下降(P<0.0001)至正常组水平,而FOXP3值明显回升(P<0.0001),差异具有显著的统计学意义。用BSP法经FOXP3基因12个CpG位点的筛选表明:AR患者FOXP3基因GCP位点甲基化率明显高于正常人水平,二者差异有统计学意义(P<0.0001),益气温阳方治疗后FOXP3基因GCP位点甲基化率下降(P<0.05)。结论益气温阳方短期疗效优于氯雷他定;益气温阳方通过抑制DNMT,减少FOXP3基因GCP位点甲基化率,从而增加FOXP3基因表达,增加FOXP3蛋白表达,从而增加Treg细胞数量,进而抑制其后的一系列免疫反应,缓解AR症状。

JAM3基因DNA甲基化在宫颈高级别上皮内瘤变及术后复发预测的临床研究

目的:探讨JAM3 (junctional adhesion molecules 3)基因DNA甲基化水平在高级别上皮内瘤变中的诊断效能,实现宫颈癌精准筛查,协助高级别上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN) II~III级分级管理,预测术后复发风险,规范宫颈上皮内瘤变治疗。研究方法:选择2020年1月至2023年1月就诊于临沂市中心医院需行宫颈活检术的200例病例,分别行HPV检查、液基细胞学检查、病理标本DNA甲基化检测。检测期间由一名固定医生取样。所有研究对象均通过阴道镜检查并进行宫颈组织病理学确诊后分组。根据病理学检查结果分为正常组、CIN I级组、CIN II级组、CIN III级组,各50例进行数据统计和临床分析。结果:正常组、CIN I级组、CIN II级组、CIN III级组JAM3基因甲基化者分别为4%、10%、38%、54%。随着宫颈病变程度的加重,JAM3基因的甲基化水平呈逐渐升高趋势。JAM3基因在正常组、CIN I组、CIN II组、CIN III组任意两组之间均存在显著差异(P < 0.01)。联合JAM3基因甲基化检测可弥补HPV低特异性及TCT低敏感性的缺陷,复发患者甲基化水平明显高于治愈者,差异具有统计学意义。结论:JAM3甲基化检测可显著提高宫颈高级别上皮内瘤变检出率,可为阴道镜检查不满意的LSIL患者分流管理提供参考;协助CIN II~III分级管理,提高病理诊断一致性;JAM3甲基化可作为高级别上皮内瘤变术后复发预测标志物。

急性髓系白血病中医证型与Dkk-3、Wif-1基因甲基化水平相关性研究

目的:研究急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)患者不同中医证型与焦磷酸测序法检测的Dkk-3和Wif-1基因启动子甲基化水平的关系,比较不同证型Dkk-3和Wif-1基因甲基化水平与AML患者生存时间的差异,为AML中医辨证分型提供参考依据及评估预后。方法:选取45例2020年6月-2021年6月福建中医药大学附属人民医院血液病科门诊或住院初诊AML患者(病例组)和20例缺铁性贫血患者(对照组),比较焦磷酸测序法检测的两组Dkk-3、Wif-1基因甲基化表达水平差异,并比较组内气阴两虚证、瘀血痰结证、毒热炽盛证三种不同证型与Dkk-3和Wif-1基因启动子甲基化水平的关系,并以AML患者死亡或随访终点(1年)为终止时间点,比较各证型患者的生存时间差异。结果:AML患者中气阴两虚证者最多,瘀血痰结证者次之,毒热炽盛证者最少,各中医证型与性别、FAB分型、骨髓原始细胞比例的差异无统计学意义(P>0.05),但不同中医证型患者年龄的差异有统计学意义(P<0.05)。AML患者的Dkk-3、Wif-1基因甲基化表达水平均比对照组高,差异有统计学意义(P<0.01)。各证型AML患者Dkk-3基因甲基化表达水平的差异无统计学意义(P>0.05);各证型AML患者Wif-1基因甲基化表达水平的差异有统计学意义(P<0.05),气阴两虚证患者的表达水平最高,瘀血痰结证次之,毒热炽盛证最小。对AML患者进行随访,中位随访0.3~24个月,中位生存时间为(11.80±6.29)个月,各个证型患者总体生存时间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:AML患者的Dkk-3、Wif-1基因甲基化阳性率较无恶性血液病患者高,Dkk-3、Wif-1基因甲基化可能与AML发病有相关性。AML患者中医证型与Wif-1基因甲基化表达有相关性,气阴两虚证、瘀血痰结证患者的Wif-1甲基化表达明显高于毒热炽盛证患者,其可能可以作为AML中医辨证分型的参考指标。各中医证型AML患者生存时间的差异无统计学意义(P>0.05),今后应采用大样本、多中心的临床试验来进一步验证中医证型与生存时间的相关性。

外周血CD4^+T细胞Foxp3基因CNS2去甲基化与绝经后骨质疏松症的关系

目的研究绝经后骨质疏松症患者外周血CD4+T细胞Foxp3基因CNS2去甲基化水平。方法纳入绝经后骨质疏松症患者42例为观察组,绝经后无骨质疏松症妇女38例为对照组。检测两组患者血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽(P1NP)、β胶原特殊序列(β-crosslaps)以及血钙含量;分离两组患者外周血CD4+T细胞,亚硫酸氢盐测序法检测Foxp3基因CNS2去甲基化水平,实时定量PCR检测Foxp3 m RNA表达量;分析以上指标之间的相关性。结果观察组中Foxp3基因CNS2去甲基化率(P<0.01)、Foxp3基因表达(P<0.01)均显著低于对照组;观察组中P1NP(P<0.01)与β-crosslaps(P<0.01)均显著高于对照组;绝经后骨质疏松症中Foxp3 CNS2去甲基化率与血清β-crosslaps呈负相关,其相关性差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 CD4+T细胞中Foxp3 CNS2去甲基化在绝经后骨质疏松症诊断中具有一定价值,其水平与骨代谢异常具有相关性。

急性期川崎病Foxp3基因甲基化改变及意义初探

目的 探讨急性期川崎病（KD）Foxp3基因甲基化状态及其在KD免疫发病机制中的作用.方法 急性期KD患儿30例,正常同年龄对照组18例,KD患儿分别于静脉丙种球蛋白（IVIG）治疗前后直接取血备检.甲基化特异性定量PCR（MSQP）检测CD4＋T细胞Foxp3基因启动子、调节性T细胞（Tr）特异性甲基化区（TSDR）CpG岛甲基化状态;流式细胞术检测外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr的比例;荧光定量PCR检测CD4＋T细胞Foxp3、CTLA4、GITR、LAG3、CCR8、UBD、LGALS3等基因mRNA表达.结果 （1）急性期KD患儿CD4＋T细胞Foxp3基因启动子CpG岛非甲基化水平明显低于同年龄对照组（P＜0.01）,经IVIG治疗后明显升高（P＜0.01）;TSDR区CpG岛非甲基化水平各组间差异无统计学意义（P＞0.05）;（2）急性期KD患儿CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr细胞比例及CD4＋T细胞Foxp3 mRNA表达水平明显低于正常对照组（P＜0.01）,且与Foxp3基因启动子CpG岛非甲基化水平呈正相关（CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr：r=0.76,P＜0.01;Foxp3：r=0.89,P＜0.01）,IVIG治疗后显著上升（P＜0.01）;（3）急性期KD患儿CD4＋CD25＋Foxp3＋Tr细胞相关因子CTLA4、GITR、LAG3和CCR8等基因mRNA水平显著降低（P＜0.01）,IVIG治疗后均有不同程度的恢复（P＜0.01）;Foxp3依赖性分子UBD和LGALS3表达水平亦低于正常对照组（P＜0.01）,IVIG治疗后基本恢复至正常水平（P＜0.01）.结论 急性期KD患儿Foxp3基因启动子非甲基化水平低下可能与KD免疫调节功能紊乱有关.

PNPLA3和FABP1基因甲基化与代谢相关脂肪性肝病相关性分析

目的 了解乌鲁木齐市代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)患病率情况及PNPLA3与FABP1基因甲基化对其发病的影响。方法 回顾性分析2022年1月—3月新疆医科大学第一附属医院进行体检人群的相关临床资料;从中招募15例MAFLD患者,匹配同期体检15名无肝病既往史健康人群采用甲基化特异PCR方法(MSP法)进行PNPLA3、FABP1基因甲基化检测。采用Point-biserial相关对临床资料及基因表达之间的相关性进行分析。结果 共纳入3 194名体检人群中1081例(33.84%)诊断为MAFLD,其中男性698例(64.57%)、女性383例(35.43%),40~50年龄段人数最多有424例(39.22%),差异均有统计学意义(P<0.001)。病例组PNPLA3基因高甲基化状态2例(13.33%),对照组10例(66.67%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.806,P=0.009);FABP1基因高甲基化状态5例(33.33%);对照组12例(80.00%),差异具有统计学意义(χ^(2)=4.887,P=0.027)。PNPLA3基因甲基化状态与空腹血糖(FPG)(r=-0.385,P<0.05)、甘油三酯(TG)(r=-0.584,P<0.05)呈负相关,高密度脂蛋白(HDL-C)(r=0.651,P<0.001)呈正相关;FABP1基因甲基化状态与尿素(UA)(r=-0.407,P<0.05)、FPG(r=-0.416,P<0.05)、TG(r=-0.565,P<0.05)、总胆固醇(TC)(r=-0.515,P<0.05)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)(r=-0.416,P<0.05)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)(r=-0.473,P<0.05)呈负相关,与HDL-C(r=0.487,P<0.05)呈正相关。结论 乌鲁木齐市MAFLD患病率处于全国高位。MAFLD患者血浆中PNPLA3、FABP1基因启动子区甲基化状态均明显降低,且与FPG、TG、TC、UA、AST、ALT和HDL-C相关,是MAFLD发生、发展的重要机制之一。

FOXP3基因启动子区甲基化与肾移植术后Th1/Th2水平和排斥反应的相关性分析

目的:分析FOXP3基因启动子区甲基化与肾移植术后Th1/Th2水平及排斥反应的相关性。方法:将2010年至2019年12月于新疆医科大学第一附属医院行肾脏移植治疗的120例患者纳入研究,根据患者术后3个月是否出现急性排斥反应(AR)将其分为AR组及Non-AR组,比较两组患者基线临床资料,辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th/Th2及FOXP3基因启动子区甲基化水平,采用多因素Logistic回归模型对影响AR的因素进行分析,并采用Pearson相关性模型分析FOXP3基因启动子区甲基化水平与Th1/Th2水平的相关性。结果:AR组患者Th1、Th1/Th2及FOXP3基因启动子区甲基化水平明显高于Non-AR组(t=2.888,2.055,2.984,均P<0.05),Th2及FOXP3蛋白水平明显低于Non-AR组(t=2.665,2.155,均P<0.05);多因素Logistics回归分析示高Th1及FOXP3基因启动子区甲基化水平是AR的独立危险因素(OR=1.390,1355.480,均P<0.05),而高Th2水平是AR的保护因素(OR=0.560,P=0.001);相关性分析显示,FOXP3基因启动子区甲基化水平与FOXP3蛋白呈负相关关系(r=-0.879,P<0.001),与Th1/Th2水平呈正相关关系(r=0.810,P<0.001),而FOXP3蛋白与Th1/Th2水平呈负相关关系(r=-0.881,P<0.001)。结论:FOXP3基因启动子区甲基化水平升高后,FOXP3基因蛋白表达水平降低,影响患者体内Th1/Th2细胞表达,从而使患者体内免疫状态发生变化,进而可能诱发排斥反应。

调节性T细胞的功能与Foxp3基因及组蛋白甲基化状态的研究进展

自从Sakaguchi首次证实调节性T细胞（regu-latory Tcells,Treg）的存在及功能至今,其一直是免疫领域内的研究热点。Treg能抑制免疫系统对自身和某些外来抗原的应答,在维持机体免疫耐受和免疫稳态方面具有非常重要的作用。现已证实,除了CD4^＋Treg外,部分CD8^＋T细胞、

抑癌基因XAF1和BNIP3表达及其异常甲基化与宫颈病变相关性研究

目的探讨抑癌基因XAF1和BNIP3表达及其异常甲基化与宫颈病变的关系。方法选择140例手术切除并经病理证实的标本,其中宫颈癌组48例,宫颈上皮内瘤样病变2~3级组织(CIN2-3组)32例,宫颈皮内瘤样病变1级组织(CIN1组)30例,正常宫颈组织(对照组)30例,采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法及免疫组化(SP)法,检测上述各组中XAF1和BNIP3启动子区甲基化状态及蛋白表达水平。结果正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组XAF1基因启动子甲基化阳性率分别为3.3%、6.6%、37.5%、60.4%,正常宫颈组与CIN1组甲基化阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3及宫颈癌组甲基化阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组BNIP3基因甲基化阳性率分别为16.7%、20.0%、43.8%、68.8%,正常宫颈组与CIN1组甲基化阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3及宫颈癌组甲基化阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组XAF1蛋白的阳性表达率分别为73.3%、76.7%、40.6%、10.4%,宫颈组与CIN1组XAF1蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN2-3组及宫颈癌组XAF1蛋白表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);正常宫颈组、CIN1组、CIN2-3组、宫颈癌组的BNIP3蛋白表达率分别为63.3%、70.0%、43.8%、14.6%,正常宫颈组与CIN1组BNIP3蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN1组与CIN2-3组、宫颈癌组比较,BNIP3蛋白表达率逐渐下降,差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组织中XAF1蛋白与BNIP3蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论XAF1及BNIP3基因启动子甲基化所致的XAF1及BNIP3表达失活,可能在宫颈病变的发生及发展过程中起着重要作用。

不明原因复发性自然流产患者FOXP3基因蛋白表达与启动子甲基化水平之间关系的研究

目的探讨不明原因复发性自然流产(URSA)患者蜕膜组织中叉头样转录因子P3(FOXP3)基因的蛋白表达水平及其与启动子甲基化水平的关系。方法利用蛋白印迹法检测20例URSA患者(URSA组)和20名正常妊娠主动要求人工流产术的健康妇女(正常对照组)蜕膜组织中FOXP3蛋白表达情况,利用结合重亚硫酸盐的测序法(BSP)检测2组FOXP3基因启动子甲基化情况,并分析两者的相关性。结果 URSA组蜕膜组织中FOXP3表达水平明显低于正常对照组(P<0.01)。BSP显示URSA组FOXP3基因启动子甲基化水平明显高于正常对照组(P<0.01)。FOXP3蛋白表达水平与FOXP3基因启动子甲基化水平呈负相关(r=-0.917,P<0.01)。结论 FOXP3基因启动子甲基化水平升高后,FOXP3基因蛋白表达水平下调,引起免疫耐受异常,可能导致RSA的发病。

调节性T细胞Foxp3基因DNA甲基化在风湿性心脏病中的研究进展

风湿性心脏病是一种因感染溶血性链球菌所引起的自身免疫性疾病。调节性T淋巴细胞(Tregs)是近年以来发现的有免疫调节功能的一群T淋巴细胞亚群,在维持人体免疫耐受和免疫应答稳态方面具有非常重要的作用,它的数量减少或功能异常与多种自身免疫性疾病有关。然而,叉头翼状螺旋转录因子^([3])(forkhead box protein P3,Foxp3)基因作为调节性T细胞的转录因子,对调节和维持其免疫抑制功能起决定性作用。目前有学者认为Foxp3基因在表观遗传学中,特别是甲基化状态对其稳定的表达有着重要作用。本文将对调节性T细胞Foxp3基因的DNA甲基化与风湿性心脏病发病机制的研究作一综述。

苯并(a)芘对变应性鼻炎模型鼻黏膜功能及Treg细胞甲基化水平的影响

目的探讨苯并(a)芘对变应性鼻炎(AR)模型鼻黏膜功能及Treg细胞甲基化水平的影响。方法36只SPF级BALB/c雌性小鼠中选取12只作为正常对照组,剩余小鼠采用随机数表法分为AR模型组和苯并(a)芘干预组,各12只。AR模型组和苯并(a)芘干预组进行建模处理。建模后,苯并(a)芘干预组腹腔注射7.89 mg/kg苯并(a)芘,正常对照组和AR模型组给予等量的无菌PBS溶液腹腔注射。对各组小鼠的鼻炎症状评分和鼻腔灌洗液细胞涂片嗜酸细胞(EOS)计数、血清中卵清蛋白特异性IgE(OVA-sIgE)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素13(IL-13)和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)水平、小鼠鼻黏膜病理学变化、小鼠鼻黏膜Th亚群及Foxp3甲基化和蛋白水平进行对比。结果与AR模型组相比,苯并(a)芘干预组中小鼠鼻炎症状评分和鼻腔灌洗液细胞涂片EOS计数增加最为明显(P<0.05),小鼠血清中OVA-sIgE、GM-CSF、TNF-α、IL-13和Eotaxin水平升高最为明显(P<0.05);苯并(a)芘干预后,可见大量的炎性细胞浸润,鼻黏膜上皮组织排列紊乱,增生和血管扩张严重,纤维上皮也受到严重的损伤,出现大量的杯形细胞,苯并(a)芘干预组小鼠鼻黏膜中AhR阳性细胞数量升高最为明显(P<0.05);Th1和Treg占比降低最为明显,Th2、Th17占比升高最为显著(P<0.05);小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3基因甲基化水平升高最为明显(P<0.05),小鼠脾脏中Foxp3蛋白水平降低最为明显(P<0.05)。结论苯并(a)芘通过增加CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3基因甲基化,降低Treg细胞比例,加重了鼻黏膜炎症和免疫失衡,进而参与变应性鼻炎的发病机制。

高危型人乳头瘤病毒感染患者宫颈脱落细胞JAM3/PAX1高甲基化诊断宫颈高级别病变

目的:传统的宫颈癌筛查手段——高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)和宫颈脱落细胞学检测存在局限性。本研究通过检测宫颈脱落细胞中连接黏附分子3(junctional adhesion molecule 3,JAM3)/配对盒基因1(paired box gene 1,PAX1)高甲基化水平,并将其与液基薄层细胞学(liquid based cytology,LBC)进行比较,评价JAM3/PAX1甲基化对于宫颈高级别病变的诊断能力,以探索新的宫颈高级别病变的诊断模式,实现宫颈高级别病变“精准筛查”的目的。方法:回顾性收集2021年6月至2022年6月在中南大学湘雅三医院妇科阴道镜门诊接受检查的患者共136例,包括宫颈非高级别病变122例,高级别病变14例。研究的变量包括:基本临床信息(年龄、体重指数、是否绝经)、LBC、hrHPV、宫颈组织病理、阴道微生态结果、阴道镜结果(宫颈转化区类型)、JAM3(ΔCtJ)和PAX1(ΔCtP)基因甲基化的ΔCt值。首先通过logistic回归分析筛选影响宫颈高级别病变的影响因素,并进行相关性分析,然后用差异有统计学意义的变量构建条件推断树模型。结果:Logistic回归分析提示高级别宫颈病变组与非高级别宫颈病变组的PAX1与JAM3基因甲基化ΔCt值以及LBC检测结果差异均有统计学意义(均P<0.05)。相关性分析发现,宫颈病理结果与ΔCtP(r=-0.360,P<0.001)、ΔCtJ(r=-0.448,P<0.001)、LBC(r=-0.305,P<0.001)、菌群多样性(r=-0.183,P=0.037)呈负相关。条件推断树显示:当ΔCtJ>10.13时,全部为宫颈非高级别病变的患者;当ΔCtP>6.22时,非高级别病变的患者有117例,占97.5%,高级别病变者仅3例,占2.5%。ΔCtJ>8.61且LBC为不明确的非鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US)或未见上皮内病变细胞时,105例(99.1%)为宫颈非高级别病变的患者,仅1例(0.9%)检出为高级别病变;当LBC结果为高级别病变时,仅9例患者检出高级别病变,3例检出非高级别病变;而当LBC提示低级别病变、ASC-US、未见上皮内病变细胞,且ΔCtP>6.22时,有117例(97.5%)的患者检出非高级别病变。结论:在人乳头瘤病毒感染妇女中,JAM3/PAX1双基因甲基化检测可独立应用于宫颈高级别病变/非高级别病变的分层诊断,且不依赖于宫颈脱落细胞学检测结果;亦可与LBC联合使用以弥补LBC敏感度低的缺点。此外,未来将甲基化试剂盒应用于大规模宫颈癌筛查,有利于发现更多宫颈高级别病变患者,并达到早筛、早治宫颈病变/癌的目的。

食管鳞状细胞癌中MT3基因CpG岛甲基化及其临床意义

目的 探讨食管癌中 MT3基因 Cp G岛甲基化的情况及其临床意义。方法 选取切除的食管鳞癌标本4 7例 ,提取肿瘤、上切缘、下切缘及转移淋巴结的标本蜡块 DNA,经重亚硫酸化处理后 ,进行 COBRA分析 ,所得结果与各临床病理参数及随访资料进行比较。结果 全组有 10例 (2 1.3% )肿瘤组织发现 MT3基因甲基化 ,其中 1例呈原位癌样改变的上切缘也检测到甲基化。全组 35枚转移淋巴结中共发现 15枚 (4 2 .9% )甲基化 ,与肿瘤组织相比 ,差异有显著性 (P=0 .0 37,χ2 =4 .35 5 )。原发肿瘤存在甲基化 10例患者中 ,每例有 (5 .7± 3.6 0 )枚转移淋巴结。而不存在甲基化的 37例转移淋巴结数为 (3.2± 2 .13)枚 ,两者比较差异有显著性 (P=0 .0 18)。肿瘤组织的甲基化情况与患者的性别、年龄、烟酒嗜好、肿瘤分期及分化程度均无关 (P值均 >0 .0 5 ,χ2 检验 )。结论 MT3基因Cp G岛甲基化与食管鳞癌的淋巴结转移状况关系密切 ,作为一个独立的预后因素 。

基因甲基化导致鼻咽癌组织14-3-3σ表达下调

为探讨14-3-3σ基因甲基化在鼻咽癌发病中的作用,以75例鼻咽癌活检组织和25例正常鼻咽黏膜活检组织作为研究对象,采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测14-3-3σ基因甲基化状态,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测14-3-3σmRNA表达,免疫组织化学染色检测14-3-3σ蛋白质表达.结果发现,鼻咽癌组织14-3-3σ基因完全甲基化、不完全甲基化和未甲基化的例数分别为4例、59例和12例,正常鼻咽黏膜组织不完全甲基化和未甲基化的例数分别为7例和18例,鼻咽癌14-3-3σ基因甲基化频率显著高于正常鼻咽黏膜组织(84%vs28%,χ2=28,P<0.05).RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示:14-3-3σ基因完全甲基化的组织样本无14-3-3σ表达,不完全甲基化的组织样本14-3-3σ表达显著降低,14-3-3σ基因甲基化与鼻咽癌淋巴结转移及鼻咽癌临床分期正相关.研究结果表明,鼻咽癌组织14-3-3σ基因存在高频甲基化,14-3-3σ基因甲基化导致14-3-3σ表达降低或缺失,14-3-3σ表达水平与鼻咽癌淋巴结转移及其临床分期相关.

贲门腺癌中SFRP1、DKK3基因启动子区甲基化状态的联合分析

目的研究贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中Wnt通路拮抗基因分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)和DKK3(Dickkopf3)基因的甲基化状态,探讨其与贲门腺癌发生的关系。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测89例贲门腺癌及相应正常黏膜组织中SFRP1和DKK3基因的甲基化状态,并分析与临床病理参数间的关系。结果89例贲门腺癌组织中SFRP1和DKK3基因发生甲基化的分别有77例(86.5%)和16例(20.0%),而正常黏膜组织中仅有15例(13.9%)发生了SFRP1基因的甲基化,未发现有DKK3基因的甲基化现象,癌组织中两基因的甲基化率均明显高于正常黏膜组织(P<0.05);SFRP1基因的高甲基化与肿瘤组织的淋巴结转移相关,而与肿瘤的浸润深度、临床分期及病理分级无关,DKK3基因的甲基化与各临床病理指标均无关(P>0.05);联合分析SFRP1和DKK3基因,在贲门腺癌组织中两基因共同发生甲基化的有12例,其共同甲基化率与肿瘤的淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)。结论贲门腺癌中SFRP1和DKK3基因的高甲基化状态可能是引起贲门腺癌发生的分子机制之一;SFRP1、DKK3基因甲基化的联合检测对于贲门腺癌的预后评估有一定的参考价值。

结直肠癌和管状腺瘤中Runx3基因启动子甲基化状态的分析

目的探讨结直肠癌及管状腺瘤中Runx3基因甲基化状态和Runx3蛋白表达,确定Runx3基因在"腺瘤→腺癌"癌变通路中的作用、临床意义及Runx3基因在不同年龄层段的甲基化程度。方法应用TaqMan探针qPCR(MethyLight)法分别检测40例管状腺瘤组织、50例结直肠癌组织和20例正常组织中Runx3基因CpG岛甲基化状态,并通过测序法验证扩增序列,同时应用免疫组化法分别检测上述标本中Runx3蛋白表达。结果结直肠癌组、管状腺瘤组、正常组中Runx3基因启动子甲基化率分别为84%、45%、10%,差异有统计学意义(P<0.05);结直肠癌组、管状腺瘤组、正常组中Runx3蛋白阳性率分别为18%、45%、80%,差异有统计学意义(P<0.05);Runx3基因甲基化与蛋白表达在正常组、管状腺瘤组及结直肠癌组中均呈负相关(相关系数r值分别为-0.667、-0.616、-0.790,P均<0.05);管状腺瘤组和结直肠癌组中Runx3基因启动子甲基化频率与患者年龄呈正相关(相关系数r值分别为0.376、0.304,P均<0.05)。结论 Runx3基因甲基化可能诱导其蛋白表达下调,在结直肠"腺瘤→腺癌"的癌变通路中起重要作用,同时Runx3基因甲基化可能与患者年龄相关,随年龄增长,甲基化程度增高。

肝细胞癌中Runx3基因启动子区甲基化研究

目的通过检测肝细胞癌中Runx3基因启动子区域甲基化状态及Runx3基因表达情况,探讨Runx3基因启动子区域异常甲基化状态在肝细胞癌发生和发展过程中的意义。方法采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝癌细胞系和52例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3种肝癌细胞系Runx3 mRNA在使用药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)前后的表达情况。结果在肝细胞癌组织中,Runx3基因启动子区域甲基化率占42.3%(22/52),而在相对应的癌旁正常组织中,Runx3基因启动子区域未发现高甲基化现象;Runx3基因启动子区域甲基化状态与患者临床病理参数均无相关关系;在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;用药物5-Aza-CdR处理后的3种肝癌细胞中Runx3 mRNA表达明显增强。结论Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。

AS_2O_3逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制。以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象。采用SRB法检测As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果表明:①As2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长。

乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达的研究

目的:研究乙肝相关性肝癌患者中Foxp3启动子区甲基化及其表达,探讨Foxp3在乙肝相关性肝癌发病中的意义。方法:使用real time RT-PCR检测34例肝癌组织中Foxp3mRNA的水平,通过焦磷酸测序的方法检测Foxp3的甲基化水平。结果:HBV阳性肝癌组织中Foxp3mRNA表达水平高于HBV阴性组,具有显著差异;HBV阳性与阴性肝癌组织中Foxp3的甲基化水平不具有统计学差异。结论:原发性肝癌患者中HBV感染使Foxp3mRNA表达升高,Foxp3mRNA表达升高可能不是或不完全是通过甲基化修饰来调控的。