重组蛋白Fpr3的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了从分子水平上进一步研究PPIase与PP1的相互作用,将构建好的pGEX-5X-1重组表达质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导后得到了可溶形式表达的融合蛋白.采用GST亲和层析法对重组蛋白进行了纯化,并用Factor Xa对融合蛋白进行柱上酶切,SDSPAGE检测表明可获得较高纯度的GST-Fpr3融合蛋白以及去除GST标签的目的蛋白.用其免疫日本雄性大耳白兔,成功制备了抗GST-Fpr3的多克隆抗体,为Fpr3的空间结构的解析和相应的分子识别过程奠定了基础.

膜联蛋白A1的N末端肽Ac2-26对高糖刺激的小鼠巨噬细胞极化的影响

目的:探讨膜联蛋白A1(ANXA1)的N末端肽Ac2-26对高糖刺激的小鼠巨噬细胞极化的影响及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),将其分为对照组、高糖组、高糖+Ac2-26组、高糖+Ac2-26+甲酰肽受体2(FPR2)拮抗剂WRW4组和高糖+Ac2-26+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂wortmannin组。ELISA检测BMDM上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和转化生长因子β1(TGF-β1)的分泌;Western blot检测BMDM中诱导型一氧化氮合酶(iNOS;M1型极化标志物)、CD206(M2型极化标志物)及ANXA1的表达,并检测PI3K和蛋白激酶B(PKB/AKT)的表达及磷酸化水平。结果:高糖刺激可以显著上调小鼠BMDM的iNOS表达及促炎因子(TNF-α和IL-6)产生(P<0.01),下调CD206表达和抗炎因子(IL-10)产生(P<0.05),并抑制细胞内PI3K/AKT的磷酸化(P<0.05);使用Ac2-26对高糖刺激的BMDM进行干预,能够显著抑制iNOS表达及促炎因子(TNF-α和IL-6)产生(P<0.05),并上调CD206表达、IL-10产生及PI3K/AKT的磷酸化水平(P<0.05);而WRW4和wortmannin能够显著抑制Ac2-26的效应(P<0.05)。结论:高糖刺激可以诱导小鼠BMDM向促炎的M1型极化,而Ac2-26可以抑制M1型极化,并促进BMDM向抗炎的M2型极化;Ac2-26的调节机制可能涉及FPR2/PI3K/AKT信号通路的激活。