Simultaneous determination of 10 nucleosides and nucleobases from different cultivation years of Fritillaria unibracteata var. wabuensis by HPLC-DAD

Determination of nucleosides and nucleobases is important for the quality control of Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C. Hsia var. wabuensis （FUW） due to their physiological and pharmacological actions. In the present study, we developed a sensitive and reliable HPLC-diode-array detection method to simultaneously determine ten nucleosides and nucleobases, including cytosine, uracil, cytidine, uridine, thymine, adenine, inosine, guanosine, thymidine and adenosine. Complete separation of all the analytes was achieved on a Zorbax 300 A 300 Extend C18 column with a gradient of methanol-ultrapure water at a flow rate of 1 mL/min in less than 30 min. The diode-array detector wavelength was set at 260 nm for the UV detection of nucleosides and nucleobases. The optimized method provided good linearity （R2〉0.9993 for all the analytes）, satisfactory precision （RSD〈3.715%）, good repeatability （RSD_〈3.748%） and good recovery （RSD from 97.688% to 102.923%）. In addition, the developed method was successfully applied to simultaneous determination of ten nucleosides and nucleobases from FUW, and their content changes of various cultivation time （1-7 years） were further analyzed for the first time. Our findings were useful for ensuring the cultivation time choice of artificial cultivation, quality control, pharmaceutical studies and clinical efficacy of FUW.

响应面法优化暗紫贝母流浸膏提取工艺及其质量评价

优化暗紫贝母流浸膏提取工艺,评价暗紫贝母流浸膏质量。以总生物碱含量、贝母辛含量、贝母素甲、贝母素乙和西贝母碱三碱含量之和、浸膏得率的综合评分作为评价指标,采用单因素实验确定乙醇体积分数、乙醇用量、浸润时间、渗漉速度4个因素对暗紫贝母流浸膏提取的影响;利用Box-Benhnken响应面法确定并验证暗紫贝母流浸膏的最优渗漉提取工艺条件;采用薄层色谱法对暗紫贝母药材进行定性鉴别,并对其水分、灰分及浸出物进行检查;采用薄层色谱建立暗紫贝母流浸膏中贝母辛、贝母素乙的定性鉴别方法,并对其乙醇量和重金属进行检查。结果表明暗紫贝母流浸膏的最佳提取工艺为:乙醇体积分数为70%,乙醇用量为18倍,浸润时间为39 h,渗漉速度为3 mL/(kg·min),在此条件下暗紫贝母流浸膏综合评分为(89.97±1.90)%。药材和流浸膏TLC结果斑点清晰,分离度好,药材水分不超过15%、灰分不超过5.0%及浸出物大于9.0%,暗紫贝母流浸膏的乙醇量和重金属检查均符合《中华人民共和国药典》流浸膏制剂规定。本研究优化的暗紫贝母流浸膏提取工艺稳定可行,为暗紫贝母开发利用提供参考。

川产道地药材暗紫贝母生态因子的动态监测研究

目的:监测暗紫贝母生态因子的动态变化。方法:在川产道地药材暗紫贝母的野生生态环境与栽培生产场地,安装溯源监测设备,利用通用分组无线服务技术(GPRS)网络进行数据的远程无线传输,通过平台网站实时获得产地的生态因子动态数据(土壤温湿度、空气温湿度、光照、气压),结合暗紫贝母的生物学特性,对不同产地与栽培环境条件下,暗紫贝母生长旺盛期的动态生态因子的变化规律进行分析。结果:生态因子是影响中药材品质的关键因素之一。海拔是影响暗紫贝母生态因子的主要因素,随着海拔的降低,相关生态因子都发生了变化,如气压升高、光照减弱、空气湿度增大、土壤温度升高。大棚对贝母生态因子如气温、光照强度的影响十分显著,可能与大棚栽培的药材形态与品质的变化之间存在一定的相关性。野生环境的生态因子优于人工栽培的条件,如伴生植被好,土壤湿度大于大田与大棚,更有利于暗紫贝母的生长。建议在适宜的生态环境中栽培与野生抚育暗紫贝母。结论:溯源监测设备能够实时获得暗紫贝母准确的生态因子数据。

暗紫贝母的物候和鳞茎在海拔梯度上的变化

在青藏高原东部的一个高山山坡上沿着海拔高度设置低、中、高3个海拔部位,在高、低2个海拔部位之间进行暗紫贝母植株的移植实验,并观察每个部位的生态因子、暗紫贝母的物候和鳞茎大小。结果表明,积雪融化完的时间、气温、土壤含水量在各部位之间有明显的差异;暗紫贝母各物候期都是在低海拔部位最先出现,中海拔部位次之,在高海拔部位最迟出现,各物候期高海拔部位比低海拔部位晚约14～25d;鳞茎平均单粒重量随着海拔的升高而降低,和低海拔部位相比,高海拔部位的鳞茎单粒重量减少了23.1%。移植实验的结果进一步证实了物候和鳞茎在高、低海拔部位之间的变化规律。暗紫贝母物候和鳞茎在海拔梯度上的变化主要是由无雪期的长度、气温以及土壤含水量等因子决定的。

暗紫贝母鳞茎培养中培养基的选择和简化试验

暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)为川贝母的主要来源之一,是我国特有的中药材,以地下鳞茎入药。用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、咯痰带血。由于川贝母对生长环境要求极苛刻,喜寒凉气候,野生分布于海拔3200～4500 m的高山高原草地上,低于海拔3000 m就不能生长。

暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究

本文应用组织培养中器官培养技术对我国特有的名贵中药材—暗紫贝母进行了生长量、生物碱含量等八个指标和培养天数关系的研究。结果表明:培养30—50d期间是鳞茎组织快速生长期,50d时鳞茎培养物中干物质积累最高,为适宜采收期。培养鳞茎在全生长阶段中生物碱含量都较高,是野生商品药材的1.22—1.50倍,从而有效地保持和提高了主要化学成分。

暗紫贝母化学成分研究

目的：研究暗紫贝母的化学成分。方法：采用反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶、氧化铝柱色谱等方法进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定化合物结构。结果：从暗紫贝母乙醇提取物的氯仿萃取部位分离得到9个化合物,分别鉴定为：cyclo-（Pro-Leu）（1）、咖啡碱（2）、贝母辛（3）、香草醛（4）、对羟基苯甲醛（5）、硬脂酸甘油酯（6）、7-ketositosterol（7）、β-谷甾醇（8）、胡萝卜苷（9）。结论：其中,化合物1、2和6为首次从贝母属中分离得到,化合物1、2、4~6为首次从该植物中分离得到。

太白贝母与暗紫贝母中4种生物碱的含量比较

采用高效液相色谱法对不同商品名称太白贝母与暗紫贝母中贝母辛、西贝母碱苷、贝母素甲、贝母素乙4种生物碱进行测定与分析,为制订质量标准和合理应用提供科学依据。结果表明,由不同品种及同一品种不同商品名称的太白贝母和暗紫贝母中总生物碱提取液的谱图显示,其主要色谱峰基本相似,但相对丰度存在明显差异。太白贝母中贝母辛、西贝母碱苷、贝母素甲和贝母素乙的含量分别为0.153 6~0.231 0、0.060 2~0.140 8、0.029 5~0.044 7、0.006 7~0.019 1 mg/kg;暗紫贝母中贝母辛、西贝母碱苷和贝母素甲含量分别为0.021 5~0.024 1、0.058 7~0.074 4、0.065 8~0.0814 mg/kg,贝母素乙未检出。同时,太白贝母中贝母辛、西贝母碱苷、贝母素甲和贝母素乙成分呈现出随着生长年限(花生大贝、花生小贝>大尖、中尖、小尖>松尖)增加而含量降低的变化趋势,所测太白贝母样品中生物碱的含量略高于暗紫贝母,具有化学等同性。

不同基源川贝母镇咳、祛痰功效差异性实验研究

目的:观察4种不同基源川贝母镇咳、祛痰的功效差异。方法:(1)将健康豚鼠70只,完全随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、暗紫贝母组、梭砂贝母组、卷叶贝母组和甘肃贝母组7组,连续给药3d,末次给药30min后,雾化吸入枸橼酸60s。记录咳嗽的潜伏期、5min内咳嗽的次数。(2)将健康小鼠60只,随机分为空白对照组、阳性对照组、暗紫贝母组、梭砂贝母组、卷叶贝母组和甘肃贝母组6组,连续给药3d,末次给药30min后,由腹腔注射0.5%酚红溶液0.5mL/只。30min后,处死小鼠,取出气管,冲洗,再加入5%碳酸氢钠溶液0.1mL,离心,取上清液,用酶标仪(波长570nm)测定OD值、祛痰指数。结果:(1)与卷叶贝母比较,暗紫贝母组、梭砂贝母组均能延长咳嗽潜伏期(P<0.05)。(2)与梭砂贝母组、甘肃贝母组、卷叶贝母组分别比较,暗紫贝母组能促进酚红排泌OD(opticaldensity)值增加(P<0.05,P<0.01)。结论:4种不同基源川贝母在镇咳、祛痰功效方面可能存在一定的差异,在镇咳方面暗紫贝母、梭砂贝母优于卷叶贝母、甘肃贝母,在祛痰方面暗紫贝母优于甘肃贝母、卷叶贝母、梭砂贝母。

组织培养川贝母化学成分和药理作用的研究

贝母为常用中药之一,味苦、性寒,有清热润肺,化痰止咳、散结等功能,用于痰热咳嗽、咯痰带血,瘰疬疮疡肿毒。国内入药主要是川贝、浙贝、平贝和伊贝。《本草纲目拾遗》

坡向对暗紫贝母生长和繁殖特征的影响

在青藏高原东部的牛牛山和卡卡山,在其东、南、西、北4个坡面各设置一个海拔相同(3800m)的样地,每个样地中随机选择30株同龄级的暗紫贝母植株作为研究对象,然后比较各坡面的生态因子以及暗紫贝母的生长和繁殖特征。结果表明:1融雪时间、气温、土壤含水量在南北坡面间有显著的差异,但土壤p H在各坡面间无明显差异。2开始生长期、始花期和盛花期等物候阶段都是北坡最迟,南坡最早,而枯黄期在各坡面间无显著差异。3单叶面积、比叶面积和植株株高以北坡最大,南坡最小。4鳞茎生物量以南坡最大,北坡最小,东、西坡面的值介于南、北坡之间。5单粒果实的生物量在各坡面之间无明显的差异,果实生物量在地上部分中所占的比例以南坡最大,北坡最小。6单粒果实平均种子数以北坡最多,南坡最少;而种子千粒重则以南坡最重,北坡最轻。可见,坡面对暗紫贝母的生长和繁殖特征有显著的影响,尤其是在南北坡面之间大多数性状差异显著。

暗紫贝母花器官特征及有性繁育系统研究

采用田间试验与显微镜检相结合的方法,对漳县人工栽培的暗紫贝母花器构造和传粉生物学进行研究,旨在揭示其花器官特征和有性繁育系统,为暗紫贝母的育种提供科学依据。结果表明,经鳞茎播种栽培3年的暗紫贝母植株单花顶生,偶见2花,花两性,初现花蕾绿色,花暗紫色,有淡黄色格纹,开花期5-6月,单花寿命6~8d,花钟形,同被花,花被6,2轮,离生雄蕊6枚,5枚紧围雌蕊,1枚外围,子房上位,柱头3裂,短裂片外露,毛状有分泌物。开花前柱头高于雄蕊,开放后雄蕊高出柱头,开花当天花粉量最大,活力最高并维持3d时间。花被长1.5cm的绿蕾柱头已具较强可受性。花药开裂与强柱头可受性同步,但后者持续期更长(6d以上)。单花花粉数约6000粒、胚珠数在160颗以上,花粉胚珠比(P/O)37.5,杂交指数(OCI)为4。传粉媒介为风媒和虫媒,访花者为蜂类、蝇类和蜘蛛,但数量极少,有性繁育系统应属于部分自交亲和,异交,需要传粉者。

培养基中蔗糖浓度及添加氨基酸对组培暗紫贝母生长的影响

研究了培养基中不同蔗糖浓度和添加Ｌ－酪氨酸或Ｌ－赖氨酸对组培暗紫贝母鳞茎的生长率和生物碱含量等的影响。结果表明：蔗糖浓度为５％时，鳞茎的生长率和生物碱含量最高，培养基中添加氨基酸可以提高鳞茎的生长率。

不同培养条件及方法对组培暗紫贝母生长的影响

暗紫贝母(Fritillaria unibracteata Hisao et K.C.Hsia)是百合科植物,其鳞茎为川贝来源之一,具有清热润肺、化痰止咳、散结等功效。但由于它喜寒凉气候,为高山、高原特有植物,只能野生生长在3000～3500 m的高山上,栽培很难成活。为了弥补野生资源的不足,探讨药材生产新途径。

HPLC-ELSD法同时检测瓦布贝母三种生物碱的含量

为了建立高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）测定瓦布贝母3种生物碱（西贝母碱、贝母辛和贝母素乙）含量的方法,本文以Tigerkin C18色谱柱（4.6＆#215;150 mm,5μm）作为分析柱,乙腈-0.1％二乙胺水（70∶ 30）作为流动相,流速1.0 mL· min-1,ELSD检测器参数设为以压缩空气为载气,流速2.5L·min-1,漂移管温度75℃进行了试验并确认其为适合的分离和检测条件.结果显示,西贝母碱、贝母辛、贝母素乙分别在0.192～3.84、0.191 ～3.82和0.178～3.55 μg范围内线性关系良好.精确度,稳定性和重复性试验的RSD均小于3％.平均加样回收率分别为97.75％、100.47％、99.40％,RSD分别为1.0％、2.6％、1.6％（n=6）.瓦布贝母样品含量测定值分别为0.0835％、0.0271％、0.0174％,RSD分别为1.3％、2.0％、2.6％（n=3）.此法用于测定瓦布贝母生物碱含量,操作简便、快捷,结果稳定可靠,可以为瓦布贝母的质量评价和控制提供参考.

组织培养暗紫贝母的药理作用

以组织培养的暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia)为材料,野生暗紫贝母为对照,用不同溶剂提取,得4个化学组分:总生物碱部分、总皂甙部分、水溶性部分和脂溶性部分,并以生药粉为阳性对照进行药效学试验。结果表明:组培贝母与野生贝母有相似的止咳、祛痰作用;总皂甙部分与总生物碱部分均为川贝有效活性成分,t检验表明两者之间无显著性差异;经TLC检查,总生物碱部分与总皂甙部分无化学成分重叠。

基于最大熵模型(MaxEnt)预测暗紫贝母的潜在分布

暗紫贝母(Fritillaria unibracteata)干燥的鳞茎是市场名贵药材"川贝"的主要来源,目前由于人们的过度挖采及环境的恶化,使得其野生资源已近枯竭,被列为国家三级濒危保护药材物种。该研究通过收集暗紫贝母的地理分布点经纬度,结合26项生态因子,运用最大熵模型(MaxEnt)并结合地理信息系统(ArcGIS),对其在中国的潜在分布区域进行了预测。结果表明:暗紫贝母的潜在适生区主要分布在四川西部和北部、青海南部、甘肃南部,其中四川阿坝藏族羌族自治州的理县、茂县、松潘县、红原县、黑水县等地区,青海省果洛藏族自治州的久治县、玛沁县、同德县、兴海县、河南县地区以及甘肃省甘南藏族自治州地区是暗紫贝母最佳适生区。此外,在西藏和云南也有零星的分布。对暗紫贝母的分布贡献率较大的主要生态因子有5个,分别是海拔(40.8%),年均降水量(28%),1月最高温度(7.1%),最干季平均温度(6.6%)和昼夜温差日均值(6.6%)。其中,海拔为2700~4 500m、年均降水量为400~1 400mm,是暗紫贝母最适宜生长的生态位参数。该研究结果为暗紫贝母的野生抚育和人工栽培提供了重要的科学依据。

暗紫贝母产生物碱内生真菌的筛选及生物碱抑菌活性的测定

目的从暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia内生真菌中筛选产川贝母类生物碱及产活性生物碱的菌株。方法利用生物碱沉淀试剂和薄层层析(TLC)技术检测发酵液中的生物碱,采用平板打孔法分别测定生物碱碱粗提液的抑菌活性,结合形态学特征和ITS序列鉴定筛得的真菌。结果筛得5株能产生物碱的内生真菌(A1、A2、A3、A11、A14),其总生物碱对金黄色葡萄球菌均有抑制作用。其中,A1、A3、A14为镰刀属Fusarium sp.真菌,A2、A11属于粘帚霉属Gliocladium sp.真菌。结论筛选出的内生真菌产生的生物碱与暗紫贝母的不尽相同,但其抑菌效果效果显著,值得进一步研究。

暗紫贝母和梭砂贝母治疗急性支气管炎(痰热咳嗽)的多中心、随机、双盲、对照试验

目的:比较不同基源川贝母(暗紫贝母、梭砂贝母)止咳、化痰功效差异性,确定最能代表川贝母止咳、化痰功效的基源种。方法:募集216例急性支气管炎(痰热咳嗽)的患者,随机分为两组。暗紫贝母组108例,采用暗紫贝母超细粉2g,口服,每日3次,疗程5d。梭砂贝母组108例,采用梭砂贝母超细粉2g,口服,每日3次,疗程5d。结果:共有210例完成了试验,其中暗紫贝母组106例、梭砂贝母组104例。随着用药时间的推进,暗紫贝母组和梭砂贝母组咳嗽、咯痰不爽及其他中医证候分值均呈降低的趋势。暗紫贝母组、梭砂贝母组主证(咳嗽、咯痰不爽)改善程度差异无统计学意义(P>0.05),次证(咽干、大便干结)改善程度差异有统计学意义(P<0.05)。暗紫贝母组、梭砂贝母组中医证候疗效比较有统计学差异(P<0.05)。暗紫贝母组和梭砂贝母组不良事件发生率比较,两组差异无统计学意义(P>0.05),且两组无严重不良事件发生。结论:暗紫贝母与梭砂贝母单独用于治疗"痰热咳嗽",均能缓解咳嗽、咯痰不爽、胸闷、咽干、尿黄、大便干结的症状,在改善咽干、大便干结症状方面暗紫贝母优于梭砂贝母。两种基源川贝母中,暗紫贝母可能更能代表川贝母清热润肺、止咳化痰之功。

暗紫贝母的繁殖器官在海拔梯度上的变异

在青藏高原东部的一个高山坡面上,沿着海拔设置高、中、低3个海拔部位,并在高、低海拔之间进行暗紫贝母植株的对换移植实验,然后测定各部位的生态因子、暗紫贝母植株花、果实和种子的特征。结果表明,1)生态因子中积雪融化时间、气温及土壤含水量在各海拔之间有明显的差异;2)花部特征中花被片的长度和宽度,雄蕊花药和花丝的长度,花柱和柱头裂片的长度都是高海拔部位最长,低海拔部位最短;3)对花生物量来说,高海拔部位比低海拔部位大39.4%;从花与地上部分二者生物量的比率来看,高海拔部位比低海拔部位大12.3%,两个指标都是高海拔部位排名第一;4)单粒果实重以低海拔部位最重,达到1282 mg,比高海拔部位大48.3%;5)单粒果实种子数以高海拔部位最少,比低海拔部位少了38.1%;6)高海拔部位的种子百粒重达到142.3 mg,而低海拔部位种子百粒重只有94.6 mg。移植实验进一步验证了上述的测定结果,这说明暗紫贝母繁殖器官确实要受海拔的影响,而且主要跟海拔梯度上的融雪时间、气温(尤其是零下低温)、紫外线强度、访花昆虫等有关。