外源性物质提高精子受精能力研究进展

受精是一个复杂的生物学过程,精子必须具备良好的运动功能,同时需经获能和顶体反应才能实现受精。通过添加外源性物质,来改善精子体外存活时间,提高精子的运动能力,尤其是冷冻保存精子解冻后的受精能力,被认为是借助实验手段在体外改善精子功能,从而提高受精率的一个有效途径。可添加的外源性生物活性物质种类很多,通常有咖啡因、氨基多糖类物质、己酮可可碱、生殖激素类物质、细胞因子、维生素、抗氧化剂、牛黄酸和一些酶类物质等。本文对精子常用的外源性添加物质的研究进展进行了总结,在此基础提出了寻找新的外源添加物质的思路和途径。

猪卵母细胞体外成熟与冷冻附睾精子的体外受精

由屠宰母猪卵巢分离得到505枚卵母细胞,经成熟培养,其中468枚卵丘细胞扩张,成熟率为92.7％。采用冷冻的附睾精子授精,受精率为41.9％(57/136),其中单精受精率36.8％(50/136),多精受精率5.1％(7/136)。授精卵体外培养24和48小时后的卵裂率分别为5.3％(15/258)和12.9％(30/232)。把35枚早卵裂期胚胎和250枚未见卵裂的1-细胞期受精卵移入4头受体母猪的输卵管内,其中2头妊娠,分别于1990年4月10日和29日正常分娩,共生产仔猪21头。

白萨福克羊细管冷冻精液试验

采用4种冷冻稀释液制作白萨福克羊细管冻精,结果表明,解冻后的精子活率以Tris卵黄组解冻后精子活率最高,与其他3组相比差异极显著(P<0.01),其中对照组(柠檬酸钠糖类)为生产中应用的配方;以Tris奶粉组解冻后精子活率最低,但与对照组和EDTA组相比差异不显著(P>0.05)。

绵羊不同品种细管冷冻精液试验

采用三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、糖类、卵黄和甘油稀释液制作绵羊细管冻精,公羊选用杜泊羊、无角陶赛特羊、特克塞尔羊、黑萨福克羊和白萨福克羊。结果表明,细管冻精解冻后活率以黑萨福克羊活率最高,与杜泊羊和特克塞尔羊相比差异显著(P<0.05),其它品种之间相比差异不显著(P>0.05)。后来发现绵羊冻精品质与其在当地的适应性有一定的相关性。

猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L^(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。

冷冻精液行供精质量分析

目的:探讨冷冻精液行供精宫颈内人工授精(ICI)的治疗周期,评价人类精子库冷冻精液的质量。方法:回顾性分析本院生殖中心AID室自2002年7月￣2004年3月用冷冻精液对有适应证的641例妇女行供精ICI1263周期的临床资料。结果:641例行供精人工授精1263个周期中共有201例获临床妊娠,截稿时已有39例分娩正常婴儿,周期妊娠率15.91%,受孕率31.35%,其中自然流产18例(8.96%),畸形引产3例(1.49%)。妊娠201例中3周期累计妊娠率98.5%(198/201)。结论:现行人类精子库的冷冻精液各项指标均达到并超过部颁标准,可用作供精ICI,建议ICI治疗周期3个。

体外受精-胚胎移植中新鲜睾丸精子与解冻后睾丸精子助孕结局比较

目的比较单精子卵泡浆内显微注射受精助孕(intracytoplasmic sperminjection,ICSI)中,使用新鲜睾丸精子与解冻后睾丸精子两组的助孕结局。方法回顾性分析2002年1月至2008年8月在本所接受ICSI助孕的272个周期,其中117个周期使用新鲜睾丸精子,为A组;155个周期使用解冻后睾丸精子,为B组。结果(1)A、B两组受精率为77.1%vs 78.9%、优质胚胎率:20.7%vs 17.5%,两组比较差异无统计学意义。(2)妊娠及出生结局分析,A、B组临床妊娠率、着床率、流产率分别为48.7%vs 52.3%、26.9%vs 32.3%、8.8%vs 14.8%。足月活产率,低体重儿发生率分别为63.2%vs 55.6%、20.3%vs29.5%,两组比较差异均无统计学意义。结论体外受精-胚胎移植中采用解冻睾丸精子其助孕结局与新鲜睾丸精子相同,解冻后睾丸精子的使用可以最大限度减少反复睾丸活检对睾丸组织的损伤,增加睾丸组织的利用率。

稀释液中添加PCS对冷冻保存过程中山羊精子质量的影响

笔者以绒山羊为试验动物,在卵黄稀释液中添加胆固醇硫酸脂(PCS),研究了在冷冻过程中PCS对精子质量的影响。添加PCS共设计了0.15,0.10,0.50g/100mL的添加量,总体分析以0.10g/100mL添加量为最佳,EY试验组显著好于EY对照组。其中,EY组解冻后精子活率、膜完整率、顶体完整率分别是34.94%、39.17%、75.24%;EY对照组分别是28.74%、30.70%、64.70%。

猪冷冻附睾精子与体外成熟卵母细胞的体外受精

研究了不同解冻温度 (39～ 41℃、5 8～ 6 0℃、6 9～ 71℃ )和解冻方式 (干解冻、湿解冻 )对猪冷冻附睾精子解冻后的活力、存活指数以及受精能力的影响。结果表明 ,采用同一种解冻方式 ,经高温解冻的精液 ,虽然解冻后的活力较好 ,但活力却下降很快 ,精子的存活时间和存活指数均不如低温解冻的精液。采用同一种解冻温度 ,湿解冻所需的解冻时间相对短 ,解冻后精子活力相对低 ,但存活时间和存活指数相应优于对应的干解冻试验组。经低温解冻的精子 ,受精能力最强 ,精子的受精能力与解冻时间呈显著正相关 (r=0 .916 13,P=0 .0 10 3)。使用改良 TCM199培养液 。

维生素E对绵羊鲜精及冻精精液品质的影响

日粮中添加维生素E可以提高绵羊鲜精的活率 ,对照组和试验组的活率分别为 0 72± 0 0 7和 0 78± 0 0 6(P <0 0 5 ) ,显著改善鲜精精液品质。采用两步稀释法在绵羊冷冻精液稀释液中添加维生素E ,可以极显著降低冷冻对精子顶体的冷刺激损害程度 ,试验组的活率 ( 0 43 5± 0 0 2 0 )极显著高于对照组 ( 0 3 65± 0 0 2 6) (P <0 0 1) ,精子顶体的总异常率试验组 ( 3 3 72 % )极显著低于对照组 ( 4 4 3 5 % ) (P <0 0 1) ,其中试验组顶体膨胀率和脱落率与对照组分别为 1 2 8%±0 5 8%、2 3 0 8%± 1 45 %与 2 68%± 0 5 9%、2 8 96%± 3 14 %。冷冻精液品质显著改善。

获能和冻融猪精子前顶体蛋白活化机制研究

利用SDS-PAGE和Western Blotting的方法,分析冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白的转化过程。结果表明,显示获能组精子荧光区域大于冻融组精子,而小于新鲜精子组;新鲜组精子出现大约45和35kDa分子量的条带,而冻融和获能组精子都同时出现大约45、35和28kDa分子量的条带。总之,冻融后顶体完整的精子和获能精子Proarosin都能正常活化成α-acrosin、β-acrosin和28kDa,这个途径可作为预测受精的指标。

临床微量精子标本冷冻方法的研究

目的探索一种安全、便捷、有效的用于微量精子冷冻的方法。方法选择内径130μm的玻璃剥卵针50支作为冷冻载体,进行10个周期的反复冻融,检测其完整性,计算不同冷冻周期中载体折损率。选取50例经检测合格的精液标本,将密度调整至(0.5~1)×10~6/ml,使用精子冷冻保护剂按照1∶1体积混合预平衡10 min,每份标本装载2支载杆,计算装载时间,其中1支载杆作为快速冷冻组,迅速投入液氮中冷冻保存,另1支载杆采用液氮熏蒸30 min后再投入液氮中保存,比较两种方法解冻后精子的复苏率。结果 50支冷冻载体中,其中有36支完成全部10轮的冷冻-复苏周期测试,折损率为28.0%,损坏原因中78.6%为金属镊子直接夹持导致玻璃剥卵针破裂。玻璃剥卵针至少可耐受4个周期反复冻融,但之后约4%~6%的会出现自发破损。100支冷冻载体装载精子时间为45~398 s,平均为(112.3±94.1)s。冷冻前平均精子活力为65.6%±9.9%,快速冷冻复苏后平均精子活力为36.64%±8.7%,熏蒸法冷冻复苏后平均精子活力为23.48%±6.2%。快速冷冻法精子复苏率为55.9%±11.0%,熏蒸冷冻法精子复苏率为36.3%±9.8%,两者比较,差异具有统计学意义(F=18.31,P<0.01)。结论采用剥卵针作为冷冻载体,并配合快速冷冻法,冷冻保存微量精子是一种安全、有效、简便的方法,适合临床广泛开展。

牛冻、鲜精子差异蛋白的双向电泳和质谱鉴定的初步研究

采用适合于精子裂解的热Trizol法制备牛精子全蛋白质,应用线性固相IPG胶条(pH 3～7、24cm)进行精子全蛋白2-DE电泳,在冻精和鲜精蛋白图谱中分别检测到839±34个蛋白点和564±16个蛋白点,经差异比较和显著性检验,在冻、鲜精子中共得到19个具有显著差异的蛋白点,在冻精中表达上调的蛋白点有9个,表达下调的蛋白点有1个,只在冻精中表达的蛋白点有9个。经过酶解和质谱鉴定,获得了3个差异蛋白点的质谱信息,生物信息学分析结果发现,这3个差异点分别为中性鞘磷脂酶激活结合因子(FAN)、谷胱甘肽S转移酶(GST-Mu5)及锌离子结合细胞色素氧化酶,分别与细胞应激和凋亡有关。推测认为,这3种与细胞应激反应及凋亡相关的蛋白在冻精中显著增高可能与精子冷冻损伤有关。

鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

旨在探究鸽蛋低密度脂蛋白(LDL)对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响。试验分为5组,分别是鲜精组、3%LDL(-80和-196℃)处理组、9%LDL(-80和-196℃)处理组。采用CASA系统分析不同处理组添加不同浓度鸽蛋LDL对冷休克及冻融前后猪精子生物学性状的影响;通过SDS-PAGE、Western blotting、PCR扩增检测分析HSP70蛋白及凋亡基因表达量的变化。结果表明:猪精子经过冻融处理后,热休克蛋白HSP70的表达量高于鲜精组,同时添加9%鸽蛋LDL并置于-196℃保存的冻融精子的热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05);在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l试验中,鲜精组的基因表达量均高于其他处理组,添加9%LDL(-196℃)处理组的基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05);在促凋亡基因Bak试验中,鲜精组的基因表达量最低,且添加9%LDL(-196℃)处理组的Bak基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05)。添加鸽蛋LDL可在一定程度上降低猪精子在冻融过程中造成的损伤,维持猪精子正常生物学性状,提高猪精子存活率。

中、重度少弱精子症患者冻融精子与新鲜射出精子的ICSI临床结局比较

目的研究中、重度少弱精子症患者冻融精子与新鲜射出精子对ICSI结局的影响。方法回顾性分析227对不育夫妇240个ICSI治疗周期,分为3组:新鲜重度少弱精子组(A组,107例,111个周期);新鲜中度少弱精子组(B组,71例,76个周期);冻融中、重度少弱精子组(C组,49例,53个周期)。比较各组的临床结果。结果新鲜重度、中度少弱精子组的可用胚胎率(分别为78.1%、75.0%)、优质胚胎率(分别为46.1%、46.2%)显著高于冻融组(分别为66.7%和37.4%)(P<0.05),但3组间受精率、正常受精率、卵裂率、临床妊娠率、种植率均无显著性差异(P>0.05)。新鲜中度少弱精子组与新鲜重度少弱精子组在可用胚胎率、优质胚胎率、受精率、正常受精率、卵裂率、临床妊娠率及种植率方面均无统计学差异(P>0.05)。结论中、重度少弱精子症患者冻融精子行ICSI影响可用胚胎率和优质胚胎率,但不影响临床妊娠率和胚胎种植率。

雄性生殖细胞冷冻保存研究进展

随着单精子及精子细胞卵胞浆内显微受精技术的发展,雄性生殖细胞冷冻保存技术已成为辅助生殖技术的重要内容,为男性因素不育患者的临床助孕提供了物质保障基础。目前,雄性生殖细胞冷冻方法包括程序化冷冻和玻璃化冷冻;冷冻保护剂可有效降低细胞的冷冻损伤,根据其特性分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂两大类;冷冻载体中冷冻环、冷冻叶片等应用较广泛。雄性生殖细胞冷冻的效果与冷冻方法、冷冻保护剂和冷冻载体等密切相关。

精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏效果的影响

目的:探讨精液冷冻前优化处理方式对不同精子活力的精子冷冻复苏效果的影响。方法:选取符合条件的标本50份,每份标本等分4份,以原液作为对照(A组),分别采用三种不同方式[洗涤法(B组)、上游法(C组)和密度梯度离心法(D组)]进行处理,再行精子冷冻复苏。比较不同精子活力标本在不同优化方法处理后的精子冷冻复苏率。结果:精子冷冻复苏率由高至低排序为A组>C组>D组>B组。B组和D组精子冷冻复苏率均显著低于A组(P<0.05),C组与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。低活力(前向运动精子PR≤32%)标本中,各处理方式精子冷冻复苏率比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常活力(前向运动精子PR>32%)标本中,B组精子冷冻复苏率显著低于其余三组(P<0.05),A组、C组、D组三组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:精液冷冻前优化处理方式对精子冷冻复苏率有影响,实际工作中,应根据精液的质量选择合适的精液冷冻前优化处理方式。

广东地区供精者精液冷冻复苏率季节变化分析

目的分析广东地区季节性变化对供精者精液冷冻复苏率的影响,为精液冷冻的最佳季节提供参考依据。方法对2016年1月—2018年12月期间10919份广东精子库供精志愿者精液的冷冻前后参数和前向运动精子冷冻复苏率进行回顾性分析。结果广东地区供精志愿者精液的前向运动精子冷冻复苏率存在季节性差异,秋季[(72.16±14.24)%]与冬季[(72.43±13.76)%]均显著高于春季[(70.46±14.03)%]和夏季[(70.72±14.55)%],差异有统计学意义(P<0.05),春季和夏季比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外,供精志愿者夏季的冷冻前和复苏后PR级精子百分率[(54.95±8.38)%和(38.76±9.41)%]、冷冻复苏后PR级精子数量[(25.18±11.74)/mL]均最低,显著低于冬春季(P<0.05)。结论季节因素的变化对广东地区供精者精液前向运动精子冷冻复苏率和复苏后前向运动精子总数均有影响,建议避免夏季进行精液冷冻保存,首选冬春季。

猪精子冷冻损伤研究进展

综述了猪冻存精子顶体、质膜和线粒体的形态学变化及其对精子受精能力的影响,同时分析了冻融精子中所发生的蛋白质、DNA等生物大分子的变化及其可能对冻存精子质量及受精能力的影响,指出冷冻保存过程对精子蛋白质、DNA等生物大分子质和量的影响是精子冷冻损伤的实质,应用先进的蛋白组学进行猪精子冷冻损伤机理研究,有助于深刻揭示冷冻损伤的分子机理,为推动猪精液冷冻保存技术研究取得突破性进展提供理论依据。

马鹿冻精解冻后精子超微结构观察

实验利用透射电镜技术和扫描电镜技术对冷冻/解冻后的塔里木马鹿精子的超微结构进行了观察。结果表明:电镜下观察,塔里木马鹿精子头部呈扁平的卵圆形,长约5.95μm。颈部很短且不明显,长约0.45μm,宽为0.62μm。尾部中段横切面近圆形,直径约为0.58μm,轴丝为9×2+2型;线粒体鞘螺旋段为64～70转。尾部末段仅见质膜包围,9束微管和1对中央微管,形成9+2微管结构。冷冻/解冻后塔里木马鹿部分精子结构发生了变化,一些精子肿胀、质膜皱褶、扭曲,部分质膜损坏或溃散;顶体轻度肿胀,顶体外膜凸凹不平,形成突起。冷冻对头部破坏程度较小。