转染FRZB基因对人胃癌SGC-7901细胞生长和转移的影响

背景与目的:FRZB(frizzled motif associated with bone development)是sFRP(secreted frizzled related protein)家族的成员,在胚胎发育过程中起重要作用。有文献报道FRZB的表达能抑制基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9表达而与前列腺癌的侵袭能力相关。本研究拟探讨FRZB基因对人胃癌SGC-7901细胞成瘤性和侵袭能力的影响,及其可能的机制。方法:构建FRZB真核表达载体并转染SGC-7901细胞,经G418筛选获得稳定表达克隆。用MTT法检测并绘制细胞增殖曲线,软琼脂培养和裸鼠皮下注射的体外和体内实验检测细胞成瘤性变化。用细胞免疫化学检测转染FRZB后细胞中MMP-2、MMP-7、MMP-9的表达变化,体外侵袭和粘附实验检测细胞侵袭能力变化。结果:筛选稳定表达细胞株经定量PCR检测,FRZB表达显著提高。体内外实验证实,转染FRZB的细胞(SGC-7901/FRZB)生长抑制率约为60%,克隆形成能力和成瘤性减弱。免疫细胞化学显示MMP-2、MMP-7、MMP-9在细胞浆内的阳性表达降低或接近阴性,对细胞外基质成分(CollagenI、IV、Vitronectin、Fibronectin、Laminin)粘附能力均增高,比空载体转染对照组(SGC-7901/vector)增加12.8%、19.8%、59.8%、26.7%、15.2%,差异具有显著性(P<0.05),而空载体转染对照组与亲本细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。SGC-7901、SGC-7901/vector和SGC-7901/FRZB细胞侵袭能力分别是每高倍视野55.90±5.68、54.80±6.97、6.60±2.63,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:FRZB高表达在体内体外均可抑制SGC-7901细胞的增殖、成瘤性和侵袭能力,具有肿瘤抑制基因的功能。FRZB抑制肿瘤细胞的生长和抑制MMP-2、MMP-7、MMP-9的表达为抑癌功能相关机制之一。

猪FRZB、ABCF1基因多态性与生长性状的关联分析

FRZB基因通过抑制Wnt信号途径调控细胞生长,ABCF1(也称为ABC50)结合e IF2,在翻译起始中发挥着重要的作用,可作为猪生长性状相关的候选基因。本研究采用直接测序法检测FRZB基因和ABCF1基因5'非翻译区中单核苷酸多态性(SNPs)基因型分布,并分析基因型与生长性状的相关性。结果表明:在美系大白猪中,FRZB基因位点ins(A-532G)多态性与背膘厚呈极显著相关(P<0.01),与体长接近显著水平(P=0.05);ABCF1基因254A/G多态性与背膘厚、左乳头数和右乳头数均呈显著相关(P<0.05);在法系大白中,ABCF1基因254A/G多态性与初生重呈显著相关(P<0.05)。结果表明,FRZB和ABCF1基因是潜在的影响猪生长性状的候选基因。

外源性FrzB拮抗Wnt信号转导并抑制人骨肉瘤细胞143B增殖

目的 Wnt信号异常激活与肿瘤发生有关,观察Wnt信号的天然拮抗剂FrzB对Wnt信号转导的影响和对肿瘤细胞增殖抑制。方法采用AdEasy系统构建重组腺病毒AdFrzB;卡那霉素抗性筛选、酶切鉴定及荧光显微镜和Western blot检测标记基因GFP和His表达等方法鉴定AdFrzB。AdFrzB与AdWnt3A共感染人骨肉瘤细胞株143B,AdGFP与AdWnt3A共感染为对照,β-catenin/Tcf荧光素酶反应系统检测FrzB对Wnt信号转导的影响;MTT实验检测FrzB对细胞增殖的抑制。结果卡那霉素抗性筛选及酶切鉴定获得pAdFrzB-His;检测到报告基因GFP和His表达,确证AdFrzB构建成功。FrzB抑制了Wnt信号转导并抑制了143B细胞增殖。结论 AdEasy系统有效构建了AdFrzB;外源性FrzB拮抗Wnt信号转导并抑制143B细胞增殖,FrzB可能是一种天然抗肿瘤因子。

藏猪FRZB基因克隆及真核表达载体的构建

分泌型卷曲相关蛋白3(sFRP3)由FRZB基因编码,其作为Wnt信号通路的抗拮剂,可调控动物的生长性能。本研究以藏猪肝脏组织为材料,应用PCR技术克隆得到猪FRZB基因编码序列,共编码325个氨基酸。构建FRZB基因的真核表达载体,经PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞来验证该载体的有效性。结果表明:藏猪FRZB基因的编码区长度为1 067 bp,成功构建了藏猪FRZB基因表达载体pIRES2-EGFP-FRZB,经转染C2C12细胞后产生绿色荧光,表明藏猪FRZB基因在C2C12细胞中成功表达。

绵羊FRZB基因InDel检测及其与生长性状的关联分析

本研究以卷曲相关同源蛋白(FRZB)基因作为候选基因,以同羊、小尾寒羊、兰州大尾羊和湖羊4个品种共计582只绵羊个体为试验材料,利用琼脂糖凝胶电泳结合DNA测序技术对FRZB基因的InDel进行筛查,旨在寻找与4个品种绵羊生长性状相关的InDel位点。结果表明,绵羊FRZB基因第1内含子上检测到一段14 bp的InDel突变;FRZB基因内含子区InDel突变位点在同羊、小尾寒羊、兰州大尾羊和湖羊群体中均存在II、ID、DD 3种基因型;关联分析表明,FRZB基因中检测到的InDel突变对同羊生长性状有显著影响(P<0.05),其中II基因型的体长、背高、荐高、距骨宽度、尾长和尾宽在同羊群体中显著优于DD基因型,可以作为候选分子标记用于同羊分子标记辅助选择。这些结果提示,绵羊FRZB基因第1内含子上一个14 bp的插入突变可显著影响同羊生长性状,可以作为绵羊育种中生长性状的潜在分子标记。

淮猪新品系猪中FRZB基因与生长性状相关位点分析

FRZB基因通过抑制Wnt信号途径调控细胞生长,可作为猪生长性状相关的候选基因。本研究采用直接测序法检测淮猪新品系四世代群体FRZB基因5′-UTR中SNPs基因型分布,并分析基因型与生长性状的相关性。结果表明:2个SNPs位点与生长性状显著相关;其中G-430A位点AA基因型个体达30 kg和90 kg体重日龄显著高于GA和GG型(P<0.05),而GA和GG型间差异均不显著(P>0.05)。C-416T位点CC型个体达90 kg体重日龄显著低于TT型(P<0.05),但CC、CT和TT基因型个体达30 kg体重日龄差异不显著(P>0.05)。结果显示,FRZB基因5′-UTR中G-430A和C-416T位点对淮猪新品系的生长性能具有显著影响,2个位点有利等位基因分别是G和C,有利基因型分别是GG型和CC型。

Wnt蛋白拮抗剂Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及稳定表达细胞株的建立

Wnt信号通路的异常活化与人类多种恶性肿瘤的发生密切相关,为探索作为Wnt蛋白拮抗剂sFRP(Secreted frizzled related protein)家族成员之一的Frzb/sFRP3在肝癌细胞中的抗癌潜力,本研究主要通过RT-PCR以及慢病毒表达系统进行了Frzb的cDNA克隆、重组慢病毒构建以及肝癌稳定表达细胞株的建立.从人正常肝细胞HL-7702中提取总RNA,通过RT-PCR获得Frzb cDNA片段并经测序证实;与此同时,将Frzb cDNA分别构建至以绿色荧光蛋白或嘌呤霉素抗性为报告基因的慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1-Frzb及pLVX-Puro-Frzb,通过酶切和测序获得正确的慢病毒重组表达质粒;其次,通过Lenti-X?Lentiviral Expression Systems将慢病毒重组表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK293T细胞,48 h后制备重组慢病毒悬液,随后感染HEK293T细胞,分别通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot验证了Frzb(FLAG标签)在细胞中的正确表达;最后,将Frzb重组慢病毒悬液感染肝癌HepG2细胞,经2μg/mL嘌呤霉素筛选成功地获得了稳定表达Frzb的细胞株.以上结果表明慢病毒表达体系对Wnt信号通路的分子靶向药物研究具有重要价值.

FRZB基因在胃癌组织中的表达和胃癌细胞内定位及其意义

目的研究FRZB基因在胃癌中的表达和在细胞内的定位及其意义。方法通过免疫组织化学（免疫组化）链霉菌抗生物素蛋白．过氧化酶连接法（SP法）对90例胃癌组织及正常胃黏膜组织FRZB基因的表达进行分析。通过定量PCR和Western印迹检测胃癌细胞株和胃上皮细胞株GES-1的FRZB表达，并用免疫荧光技术对FRZB的细胞内定位进行研究。结果FRZB在胃癌中的表达高于正常胃黏膜，在胃癌组织中，FRZB表达阳性率为92．2％，而正常胃黏膜中除了1例（10．0％）为弱阳性表达外，其余均为阴性。FRZB在胃癌组织中的表达与分化程度（P=0．220）和Lauren分型（P〈0．01）相关，与其他的临床病理参数不相关。免疫荧光和Western印迹结果显示，FRZB在细胞核和细胞质中均有表达。定量PER结果显示，在胃癌细胞株中FRZB表达高于GES-1。结论FRZB与胃癌的分化和肠型及弥漫型的发生相关，FRZB在细胞核的定位可能与其在胃癌中的作用相关。

卷曲相关蛋白mRNA调节WNT信号通路对非小细胞肺癌的预后影响

目的揭示卷曲相关蛋白(FRZB)mRNA表达在肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中潜在的临床应用价值和生物学作用。方法使用关键词“lung cancer”在隶属美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因表达综合数据库(GEO)中搜索相关数据,并且在癌症基因图谱数据库(TCGA)中下载肺腺癌和肺鳞癌数据。共8个肺腺癌和6个肺鳞癌数据集纳入研究。通过Cutoff Finder网站确定FRZB mRNA的临界值,并计算高、低表达组的风险比(HR)。结果肺腺癌患者癌组织中高表达FRZB mRNA具有更好的预后[单因素分析:HR(95%CI)=0.54(0.46~0.64),P<0.05;多因素分析:HR(95%CI)=0.66(0.54~0.79),P<0.05]。但在肺鳞癌中FRZB mRNA表达量对预后没有显著影响[单因素分析:HR(95%CI)=1.11(0.67~1.84),P>0.05;多因素分析:HR(95%CI)=1.13(0.71~1.78),P>0.05]。经过t-SNE和相关分析发现FRZB对WNT通路具有抑制作用。通过富集分析发现与FRZB相关基因富集于多条免疫相关通路,如补体系统、体液免疫等。结论高表达的FRZB mRNA对于肺腺癌具有更好的预后作用,其可能机制是通过抑制WNT信号通路实现。提示FRZB可作为一个潜在的肺腺癌预后良好标志物。