分枝杆菌表达质粒的快速构建及ClpC2基因功能初步研究

目的通过一种不受到序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,检测其在耻垢分枝杆菌中的蛋白表达并对其功能进行初步探讨。方法利用识别甲基化位点的内切酶Fsp EⅠ进行一步法酶切、连接反应,构建重组质粒PMV261(+)-Clp C2。将重组质粒转入耻垢分枝杆菌,利用SDS-PAGE和Western blot检测Clp C2基因在耻垢分枝杆菌中的表达以及氧化应激、酸应激对其功能进行初步探讨。结果利用Fsp EⅠ快速构建了分枝杆菌表达质粒Clp C2,将其成功电转至耻垢分枝杆菌中,SDS-PAGEA和Western blot检测其蛋白的表达,His单抗和兔多抗均能检测到目的条带,Mr大小27 570。氧化应激及酸应激实验表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌与空载耻垢分枝杆菌在对抗应激方面无明显差异。结论成功构建了一种不受序列限制的分子克隆方法以及分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,Western blot表明其具有一定的免疫原性,氧化应激及酸应激表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌对抗应激方面无明显改变,为进一步深入研究Clp C2基因的功能奠定了基础。