Fugene6——一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法

目的建立一种介导体外真核细胞高效率基因转染的新方法。方法采用一种新的非脂质体基因转染试剂 Fu-gene 6 ,以人 p14ARF蛋白表达载体 (p CI- neo- p14ARF)为外源 DNA,转染存在 p14ARF基因原发缺失的人 H46 0 ,A5 49,U2 5 1和 PC- 3共 4个癌细胞系 ,通过 G418筛选 2 1d确定转染效率。结果经转染的 4个细胞系培养孔中均长出了抗 G418细胞克隆 ,而且这些细胞克隆的 p14ARF基因 PCR产物均为阳性 ,细胞毒性分析发现高浓度 Fugene6作用下各细胞的增殖活力未受影响。结论 Fugene 6为一简便快速、易操作。

LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效率比较

目的:比较LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效果。方法:将含有Firefly和Renilla荧光素酶基因的质粒分别用LipofectAMINE2000和Fugene6转染293T、HepG2和DLD-1细胞,于48h后裂解细胞测定荧光素酶活性。结果:在293T细胞中,LipofectAMINE2000转染组的萤火虫(Firefly)和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的6.5和5.6倍(P<0.005);在HepG2细胞中,LipofectAMINE2000转染组的Firefly和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的44和49倍(P<0.001);而在DLD-1细胞中,两者无差别。结论:转染试剂LipofectAMINE2000和Fugene6对不同细胞的转染效果存在差异,当进行转染实验时,对于不同的细胞须根据情况进行选择。

FuGENE6介导雌激素受体质粒HEGO5转染不同乳腺癌细胞株后受体的表达

背景及目的:基因转染技术是研究乳腺癌细胞雌激素受体(estrogenreceptor,ER)的表达及其作用机制的重要手段。本研究检测不同人类乳腺癌细胞株以FuGENE6试剂为载体进行转染时的转染效率,以及ER质粒HEGO5转染后ER的表达情况。方法:不同乳腺癌细胞株先用pEGFP-N1质粒转染,流式细胞术(flowcytometry,FCM)对转染效率进行测定。将转染效率高的细胞株分别再用HEGO5转染,用FCM和Westernblot方法对ER的表达情况进行检测。结果:乳腺癌细胞株MM-231、MM330、MM134Ⅵ、MM175Ⅶ、MM157、MM361、MM436、MM453、UaCC812、UaCC893、BT-549、BT-20、HBL-100、Hs578t、MCF-7、T-47d、ZR-75-1的转染效率存在很大差异。细胞株HBL-100重复性转染实验的变异系数为5.1。几种转染效率较高的细胞株MCF-7、HBL-100、Hs578t、MM436、MM453和BT-20用HEGO5转染后,ER阳性的表达率介于12.9%～54.8%之间,与pEGFP-N1的转染效率相当;不同细胞ER的FCM和Westernblot检测结果一致。此外,ER的表达具有一定的细胞周期特异性。结论:FuGENE6试剂介导乳腺癌细胞进行转染时重复性好、结果稳定。HEGO5转染后ER的表达情况可分别用Westernblot和FCM进行定性、定量检测。

用Fugene6制作高滴度慢病毒方法的优化比较

针对实验室中比较普遍的包装的慢病毒滴度不高的问题,我们对慢病毒包装过程中的几个关键步骤进行了优化。采用Fugene6同时转染携带GFP的质粒和包装慢病毒所必需的包装质粒进入293T细胞中。通过使用荧光显微观察GFP的表达亮度及流式细胞技术测量GFP阳性细胞的比例来测定病毒滴度。通过优化Fugene6和DNA的比例,发现当Fugene6和DNA的比例是3:1时获得的慢病毒的滴度最高;通过对转染后收获病毒的时间的比较,发现转染48小时后回收所得到的慢病毒滴度最高。

FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响

目的探讨转染试剂FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响,并寻找最佳的转染比例。方法采用转染试剂FuGNE6(以6μl为例)与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为6∶0.5,6∶1,6∶1.5,6∶2,6∶4,6∶6及GPC3-iRNA量固定1μg(以此为例),转染试剂与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为2∶1,4∶1,6∶1,8∶1,10∶1进行转染。分别用荧光显微镜、流式细胞仪及PI染色实验观察细胞转染效率及48h细胞存活率。结果FuGNE6固定为6μl时,质粒用量从0.5-2μg转化效率逐步增高,超过2μg后转染效率反而大大降低,各比例组在48h细胞存活率都在95%以上;质粒量固定为1μg时,随转染试剂增加转化效率不断增大,超过6∶1时,随转染试剂增加,48h细胞存活率也逐渐下降。结论FuGNE6与GPC3-iRNA比例为6∶1.5时转化效率最大,且细胞存活率高。