基于IL-6/STAT3和IL-2/STAT5信号通路探讨伏九贴敷药物调控Th17/Treg免疫平衡的抗哮喘作用机制

目的考察伏九贴敷药物(白芥子、甘遂、延胡索、细辛组成)通过IL-6/信号转导器和转录激活因子3(STAT3)、IL-2/信号转导器和转录激活因子5(STAT5)信号通路对哮喘大鼠CD4+T辅助细胞17(Th17)/CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)平衡的调节作用,揭示其抗哮喘的作用机制。方法采用卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝混合液致敏激发造模,然后于大鼠大椎穴、肺俞穴和肾俞穴敷上伏九贴敷药物,每次贴敷4 h,隔日1次,共给药7次。采用免疫组化检测肺组织Th17特异细胞因子IL-17、Treg转录因子Foxp3的阳性表达;流式细胞术检测外周血中Th17、Treg细胞比例;免疫蛋白印迹法检测肺组织IL-6/STAT3和IL-2/STAT5通路相关蛋白的表达。结果与模型组比较,伏九贴敷组大鼠肺中IL-17的阳性表达量明显减少(P<0.01),Foxp3的阳性表达明显增加(P<0.05);同时IL-6蛋白和STAT3磷酸化蛋白表达水平明显降低(P<0.01),而IL-2蛋白和STAT5磷酸化蛋白表达水平明显升高(P<0.01),但总STAT3和STAT5蛋白表达均没有明显变化(P>0.05)。此外,伏九贴敷组大鼠外周血中Th17细胞比例低于模型组,而Treg细胞比例高于模型组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论哮喘大鼠存在Th17/Treg免疫失衡,伏九贴敷药物可通过抑制哮喘大鼠IL-6表达,下调磷酸化STAT3的表达,降低产生IL-17的Th17细胞水平;同时增加IL-2表达,介导STAT5磷酸化,升高表达Foxp3的Treg细胞水平,促进Th17/Treg趋于平衡,抑制大鼠哮喘免疫应答,从而发挥抗哮喘效应。

多指标综合评分法优选伏九贴膏乙醇提取工艺

目的研究伏九贴膏的乙醇提取工艺。方法以延胡索乙素、麻黄碱、芥子碱含量及出膏率为综合评价指标,通过L9(34)正交试验考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间及提取次数对伏九贴膏醇提工艺的影响。采用HPLC测定 3 种指标成分的含量,延胡索乙素∶流动相甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0)(50∶50),检测波长280 nm;麻黄碱∶流动相乙腈-1.5%十二烷基硫酸钠(53∶47),检测波长210 nm;芥子碱∶流动相乙腈-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液(10∶90),检测波长326 nm。结果最佳提取工艺为60%乙醇,6倍量,回流提取2次,每次1 h。延胡索乙素、麻黄碱、芥子碱含量分别为0.296%,0.079%,1.97%,平均干膏率 16.23%。结论优选的醇提工艺稳定可行,适用于伏九贴膏的工业化生产。

伏九贴敷药物对哮喘大鼠炎性反应及Th17/Treg漂移的拮抗作用

目的探讨伏九贴敷药物对哮喘大鼠炎性反应及CD4+辅助性17型T细胞(Th17)/CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)失衡的干预作用。方法将30只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、假贴敷组、伏九贴敷组、地塞米松组,每组6只。除正常组外,其余组大鼠均采用卵蛋白和氢氧化铝混合液致敏造模。末次造模后,伏九贴敷组将带有药物的伏九贴敷于大鼠大椎、肺腧(双侧)、肾腧(双侧)穴并用胶布固定,每次贴敷4 h,隔日1次,共7次;假贴敷组同样方法贴无药空白胶布,隔日1次,共7次;地塞米松组腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg,隔日1次,共7次;正常组和模型组不做任何处理。干预结束后取肺组织行HE染色观察其病理形态变化,对支气管周围炎性浸润、上皮细胞脱落、组织水肿和肺泡间隔增厚情况进行病理学评分,取血检测血清免疫球蛋白E(IgE)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、Th17相关细胞因子白细胞介素-17(IL-17)、Treg相关细胞因子白细胞介素-10(IL-10)水平,分析各项肺组织病理学评分及血清IgE、TNF-α、IL-1β水平与血清IL-17、IL-10水平的相关性。结果模型组和假贴敷组大鼠支气管黏膜上皮细胞明显脱落,黏膜下层炎性细胞浸润及水肿,支气管腔狭窄,肺泡间隔明显增厚;肺组织炎性浸润评分、上皮细胞脱落评分、组织水肿评分、肺泡间隔增厚评分及血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明显高于正常组(P均<0.05),血清IL-10水平均明显低于正常组(P均<0.05)。伏九贴敷组和地塞米松组大鼠支气管黏膜偶见炎性细胞浸润,上皮细胞散在脱落,肺间质轻微增生;上述各项肺组织病理评分及血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明显低于模型组(P均<0.05),血清IL-10水平明显高于模型组(P均<0.05)。相关性分析显示,哮喘大鼠各项肺组织病理评分和血清IgE、TNF-α、IL-1β水平与血清IL-17水平均呈显著正相关性(P均<0.05),与血清IL-10水平均呈显著负相关性(P均<0.05)。结论伏九贴敷药物能有效减轻哮喘大鼠肺组织病理损伤,降低血清炎性因子水平,拮抗炎性反应,纠正Th17/Treg漂移状态,具有显著的抗哮喘效应。

伏九贴敷药物通过调控RORγt、Foxp3 mRNA表达重塑Th17/Treg免疫平衡的抗哮喘机制初探

目的通过考察伏九贴敷药物对哮喘模型大鼠气道炎症反应、Th17/Treg相关细胞因子及特异性转录因子(RORγt mRNA、Foxp3 mRNA)表达的影响,研究其调节Th17/Treg平衡的抗哮喘效应。方法采用卵蛋白(OVA)和氢氧化铝联合致敏激发建立大鼠哮喘模型,然后于大鼠大椎穴、肺俞穴和肾俞穴给予伏九贴敷药物,每次贴敷4 h,隔日1次,共给药7次。取肺组织进行PAS染色观察气道上皮杯状细胞增生和黏液分泌变化,并进行病理评分。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测大鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相对表达量。结果哮喘模型大鼠气道黏膜上皮可见大量PAS染色阳性细胞存在,病理评分明显高于正常组;同时TNF-α、IL-1β及Th17相关的IL-17、RORγt表达增加,而Treg相关的IL-10、Foxp3表达减少,IL-17/IL-10和RORγt/Foxp3升高,出现Th17/Treg失衡现象。干预后,伏九贴敷药物能明显减少哮喘大鼠气道上皮PAS阳性细胞,降低其病理评分;并且下调TNF-α、IL-1β、IL-17及RORγt表达,升高IL-10、Foxp3的表达水平,降低IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3水平。相关性分析显示,Th17相关因子RORγt和IL-17的表达以及IL-17/IL-10和RORγt/Foxp3比值与TNF-α、IL-1β表达水平成正相关,而Treg相关因子Foxp3、IL-10的表达与TNF-α、IL-1β表达量成负相关。提示Th17可能为促炎因素,而Treg能抑制炎症介质表达。结论伏九贴敷药物可能通过下调RORγt、IL-17表达水平,同时上调Foxp3、IL-10的表达,使IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3比值降低,促进Th17/Treg趋于平衡,从而减少炎症介质TNF-α、IL-1β的表达量,减轻肺组织气道炎症反应,发挥抗哮喘作用。