哺乳动物卵透明带蛋白中C端furin位点存在的意义

根据已克隆的各哺乳动物物种卵透明带(ZP)三种蛋白质的cDNA序列推断,在它们编码的蛋白C端跨膜区上游几乎都存在RXK/RR基序。先前报道存在于许多蛋白C端的这一基序是furin蛋白酶的一个酶切位点。因此,为了阐明各ZP蛋白组份在分泌组装成ZP带时,是否在此furin位点经历了加工处理,以致丢弃它们C端的疏水性跨膜区,几个实验室相继从不同角度用不同方法进行了探讨。从目前的大多数实验结果来看,三个ZP组成蛋白分泌前在它们C端跨膜区上游的furin位点被切割的证据是充分的。当然也有相反的实验证明,即各ZP蛋白不经历此位点切割也能被分泌并进行ZP组装和扩张。对此截然相反的研究结果,一个可能的解释,也许是重组小鼠ZP3中分别选用了不同的表位标签和插入位置以及使用了不同的转染细胞株。

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响,本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段,并分别克隆至pCAGGS载体中,构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag,均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞,48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T;利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系,并均经western blot鉴定。结果显示,上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、RRRR、SRAS和AAAA质粒分别转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot检测S蛋白的表达。将pRRAR-Flag和pFurin-His共转染HEK293T细胞;同时将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞,24 h后利用western blot检测上述两种细胞中S蛋白的表达。结果显示,转染pRRAR-Flag的细胞中检测到S蛋白和S2亚基的表达,即Furin能够切割S蛋白,但转染pAAAA-Flag和pSRAS-Flag的细胞中均检测不到S2亚基的表达,转染p RRRR-Flag的细胞中S2亚基的表达量增加。与仅转染pRRAR-Flag的对照细胞相比,在HEK293T细胞中共转染pFurin-His和pRRAR-Flag能够显著增加S蛋白切割为S2亚基的量;而在Furin-KO细胞中未检测到S2亚基的表达。采用假病毒系统包装Furin裂解位点RRAR及其突变体(SRAS、AAAA)的假病毒SARS-CoV-2;利用HEK293T和Furin-KO细胞包装SARS-CoV-2假病毒,通过计算荧光素酶活性Luc与各病毒p24蛋白含量的比值比较不同假病毒对Huh7-A+T细胞及内源性Furin对两种细胞包装的假病毒的相对感染性。结果显示,与pRRAR-Flag及HEK293T细胞包装的假病毒相比,pSRAS-Flag和pAAAA-Flag及Furin-KO细胞包装的假病毒对Huh7-A+T细胞的感染性均极显著降低(P<0.01)。将质粒pEGFP-RRAR、pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA与pEGFP-Furin分别转染HeLa细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察Furin蛋白和S蛋白在细胞中的定位;将前4种质粒与表达Furin-His的质粒共转染HeLa细胞,24 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测Furin蛋白和S蛋白及其突变体在细胞中共定位。观察结果可见,Furin蛋白主要位于细胞浆中,S蛋白与Furin裂解位点突变的S蛋白均位于细胞膜;IFA结果显示,Furin与S蛋白及Furin裂解位点突变为RRRR的S蛋白在细胞浆中均存在共定位,但与Furin裂解位点突变为AAAA的S蛋白不存在共定位。将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-m Cherry共转染HEK293T细胞,同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h后将两种细胞混合培养,24 h后观察结果显示,共转染pRRAR-Flag和pCAGGS-m Cherry的HEK293T中出现明显的合胞体,而当Furin裂解位点突变为SRAS时,合胞体的形成明显减少。本研究首次证实Furin在细胞浆中对S蛋白预切割,且将S蛋白的Furin裂解位点突变为SRAS后能够降低SARS-CoV-2的感染性和细胞合胞体的形成能力。本研究为新冠疫情的防治提供新思路。

弗林蛋白酶的研究进展

弗林蛋白酶(Furin)属于枯草杆菌蛋白酶家族的细胞内丝氨酸Ca2+依赖性内肽酶,是前蛋白转化酶(PCs)家族中的一员,在人体的各种组织和细胞中普遍存在。Furin分别在内质网和高尔基体中进行自剪切后活化,活化后的Furin能激活细胞内众多具有重要功能的蛋白质前体。Furin在人体众多的生理过程中处于必不可少的位置,它不仅出现于各种前体蛋白加工以及许多生长因子的成熟过程中,还涉及许多疾病,如由新冠病毒引起的感染、骨相关疾病和肿瘤等,具有重要的生物学功能。

miR-808通过调控TGF-β1改善心肌梗死后心肌纤维化的机制

目的:探究miR-808通过调控TGF-β1改善心肌梗死后的心肌纤维化的机制。方法:70只健康大鼠,随机选取60只通过冠状动脉结扎法构建大鼠心肌梗死模型,为心肌梗死模型组(心梗组,60只),其余10只为对照组(Control组,10只),术后1周,选取20只心梗组大鼠进行重装慢病毒转染分为miR-808前体组(Pre-miR-808,40μmoL/L)和miR-808抑制剂组(anti-miR-808,40μmoL/L);转染后1周,Masson染色观察各组大鼠心肌组织;提取培养大鼠心脏成纤维细胞和细胞总RNA,RT-PCR检测TGF-β1、Furin蛋白和α-SMA的合成水平,观察miR-808通过调控TGF-β1改善心肌梗死后的心肌纤维化的机制。结果:转染后1周,Masson染色心肌组织切片,心梗组心肌梗死区细胞明显减少,边缘区心肌细胞代偿性肥大,大量排列紊乱的结缔组织增生和炎性粒细胞浸润,部分心肌纤维溶解或断裂,大量胶原纤维沉积;miR-808前体侵染心梗组1周后,组织病变有明显改善,心肌细胞增多、胶原纤维沉淀减少;术后1周,RT-PCR结果显示,与Control组比较,心梗组心肌组织miR-808表达降低,而TGF-β1mRNA的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);转染后1周,RT-PCR结果显示,转染miR-808前体能抑制心脏成纤细胞TGF-β1、Furin蛋白和α-SMA的合成水平,而抑制miR-808则能提高TGF-β1、Furin蛋白和α-SMA的合成水平,并且高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-808可通过靶向作用于Furin蛋白和α-SMA的合成水平调控TGF-β1改善心肌梗死后心肌纤维化。

Furin在神经精神疾病中作用机制的研究进展

弗林蛋白酶(Furin)作为细胞内具有剪切活性的蛋白酶,在众多蛋白质的生产和分泌过程中通过剪切不具备生物学活性前体蛋白的特定位点,使其活化获得相应生物学功能。作为一种重要的前体蛋白转化酶,Furin在神经系统中的作用底物主要包括一些生长因子、基质金属蛋白酶、肽类激素及其前体等,这些底物对癫痫、阿尔茨海默病、缺血性脑卒中和精神分裂症等重大神经精神疾病的发生发展具有重要的调控作用。该文概述了Furin的基本结构与生物学功能,Furin在一些重要神经精神疾病中的具体作用、相应机制,以及Furin活性调节剂等方面的最近研究进展。

Furin的生物学功能

弗林蛋白酶(Furin)是一种高度特异性的丝氨酸内切蛋白酶,属于前蛋白转化酶(proprotein convertases,PC)家族。Furin的前体蛋白依次在内质网和高尔基体中经过两次自剪切后而活化,其能识别特定的氨基酸序列并通过蛋白水解切割修饰而激活分泌途径中许多重要的多肽和蛋白的前体。Furin底物众多,涉及许多疾病,包括癌症、动脉粥样硬化和由细菌或病毒引起的感染等,因此具有重要的生物学功能,探究其与相关疾病的关系从而为预防和治疗找到新的靶标。

LINC01197/FURIN轴调控小胶质细胞C-反应蛋白表达并参与精神分裂症发生的机制

目的初步探讨小胶质细胞内LINC01197/FURIN信号轴调控C-反应蛋白表达以及与精神分裂症(schizophrenia,SZ)发生的关系。方法生物信息学分析初步筛选SZ患者与正常人差异表达lncRNA,Starbase 2.0分析lncRNA结合的靶基因。构建BV-2细胞损伤模型。双荧光素酶报告基因实验检测LINC01197与FURIN的靶向结合情况。通过慢病毒感染敲低/过表达BV-2细胞LINC01197/FURIN,CCK-8技术评估细胞增殖情况,ELSIA技术检测细胞炎性因子表达情况;RT-PCR检测C-反应蛋白、LINC01197、FURIN表达及C-反应蛋白含量的变化情况;ELISA技术检测C-反应蛋白表达情况。结果生物信息学分析结果显示,SZ患者中C-反应蛋白表达明显升高,LINC01197、FURIN表达明显降低。体外培养BV-2细胞,双荧光素酶基因报告实验结果显示LINC01197与FURIN靶向结合。CCK-8结果显示,LINC01197/FURIN过表达后,细胞增殖能力明显增加(P<0.05)。ELISA结果显示,LINC01197/FURIN过表达后,C-反应蛋白的表达明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示,LINC01197过表达后FURIN表达明显增加(P<0.05)。FURIN敲低/过表达后,LINC01197的表达无明显变化。结论C-反应蛋白可以作为评估SZ患者病情的有效生物标志物;而在小胶质细胞内LINC01197/FURIN信号轴可以调控小胶质细胞C-反应蛋白的表达。

CHO细胞重组抗体表达载体的构建策略及进展

近年来,重组蛋白被用来治疗多种不同的疾病,其中重组单克隆抗体是增长最快速的一类生物治疗性重组蛋白。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是目前最常用的重组抗体生产的宿主细胞。表达载体是重组抗体表达的重要部分,直接影响抗体表达的水平和质量。目前, CHO细胞重组抗体表达载体的构建策略主要有单顺反子表达载体、多启动子表达载体、IRES连接载体、Furin-2A连接载体、抗体融合蛋白等。其中, Furin-2A连接载体由于具有多种优点而逐渐成为表达重组抗体的一种重要策略,尤其是其具有较高的自剪切效率、连接的两个基因表达较为平衡、基因序列短小等优点。该文概括了目前构建CHO细胞重组抗体表达载体的策略、优缺点及其进展。