甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari CYP51基因克隆及遗传转化

甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是生物细胞膜合成所需的一个非常重要的酶,在病原菌的耐药性、致病性和生长繁殖等方面发挥着非常重要的作用。研究表明干扰真菌的CYP51基因表达导致其无法正常生长,显著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)为试验材料,根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。生物信息学分析表明,该基因序列全长1947 bp,编码区由2个内含子和3个外显子组成,CDS全长1554 bp,编码517个氨基酸,编码蛋白理论相对分子量为58.61 kDa。其编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,具有典型的CYP51保守结构域。预测其亚细胞定位于细胞膜,且存在2个跨膜区域。系统进化分析表明,FsCYP51基因属于CYP51C这一类,与串珠镰刀菌(F.verticillioides)的CYP51C基因亲缘关系最近。同时,根据克隆到的基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体,并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料,为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。

美国引进甘蔗材料对梢腐病菌(Fusarium sacchari)的室内抗性评价

为了筛选抗甘蔗梢腐病的优异种质材料,采用室内离体接种方法对70份甘蔗种质材料进行梢腐病抗性鉴定。根据发病程度划分的抗性等级和聚类分析的方法综合评价种质材料的抗性。结果表明,甘蔗分蘖期对梢腐病菌的免疫力较伸长期差。参试的70个种质材料中,高抗材料6个,占8.57%;抗病材料15个,占21.43%;中抗材料13个,占18.57%;中感材料12个,占17.14%;感病材料13个,占18.57%;高感材料11个,占15.71%。在2次不同生育期接种过程中‘HoCP02-263’均未发病,很可能是对Fusarium sacchari免疫的材料。系统聚类分析的结果与材料的抗性表现基本一致。甘蔗梢腐病的抗性评价较佳时期为分蘖期。

甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari的生物学特性及防治药剂筛选

为明确甘蔗镰刀菌(Fusarium sacchari)的生物学特性并筛选出有效防治甘蔗梢腐病的药剂,本研究测定了温度、pH、碳源、氮源和光照对甘蔗镰刀菌菌丝生长速率和分生孢子萌发的影响,采用菌丝生长速率法测定了8种杀菌剂的毒力作用并进行田间防治试验。研究结果表明,甘蔗镰刀菌的菌丝在光暗交替条件下生长差异不明显,最适宜菌丝生长和孢子萌发温度均为28℃,分生孢子的致死温度为63℃;最适菌丝生长和分生孢子萌发的pH均为8。在供试碳源和氮源中,最适合甘蔗镰刀菌菌丝生长的碳源和氮源分别为麦芽糖和酵母粉;最适合分生孢子萌发的碳源和氮源则分别为蔗糖和硝酸钠。在室内毒力测定的8种供试杀菌剂中,50%咪鲜胺锰盐、25%氰烯菌酯和50%多菌灵对甘蔗梢腐病菌具有强的毒力,其EC50依次为0.083、0.271和0.380 mg/L;田间防治试验结果显示,25%氰烯菌酯1 200倍液和50%多菌灵可湿性粉剂500倍液、12%中生菌素、70%恶霉灵和20%粉锈宁等药剂的800倍液均梢腐病能较好地控制病害的发展,防治效果均为96.00%,具有较好的推广应用潜力。本研究为进一步防控甘蔗梢腐病提供一定的参考。

人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari转化产物成分研究

目的利用甘蔗镰孢Fusarium sacchari对人参茎叶皂苷进行生物转化。方法转化产物通过硅胶柱色谱进行分离,经理化常数和光谱分析鉴定化合物的结构。结果从人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari转化产物中分离鉴定了10个化合物,分别为20(S)-人参二醇(1)、20(S)-原人参二醇(2)、20(R)-原人参二醇(3)、20(S)-人参三醇(4)、20(S)-原人参三醇(5)、20(R)-原人参三醇(6)、20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CK)(7)、人参皂苷F1(8)、人参皂苷Rh1(9)和人参皂苷Rg1(10)。结论化合物1~10为首次从人参茎叶皂苷的Fusarium sacchari生物转化产物中分离得到,且Fusarium sacchari可转化人参茎叶皂苷生成稀有抗肿瘤皂苷,是一种具有开发价值的稀有活性菌株。

Fusarium sacchari转化三七茎叶皂苷中新化合物的分离和鉴定

目的利用甘蔗镰孢Fusarium sacchari对三七茎叶皂苷进行生物转化,以发现新的稀有抗肿瘤活性成分。方法转化产物通过硅胶、凝胶及液相色谱进行分离,得到化合物结构经波谱鉴定。结果分离得到了1个单体化合物,命名为三七皂苷-LZ(notoginsenoside-LZ),鉴定其化学结构为20(S)-3β-hydroxy-12β,23-epoxy-dammar-24-ene-20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside。结论三七皂苷-LZ(notoginsenoside-LZ)为一新化合物。

甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病(pokkah boeng disease,PBD)是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F.sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1个插入位点可以影响1个以上的功能基因。T-DNA插入位点多为编码区和启动子区,少数为终止子区和间隔区。受影响的基因分别编码α-甘露糖苷酶(alpha-mannosidase)、中性氨基酸渗透酶(neutral amino acid permease)、寡聚高尔基复合体成分4(oligomeric golgi complex component 4)、寡肽转运蛋白(oligopeptide transporter)、酰基辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase)、乙酰乙酰-CoA合成酶(acetoacetyl-CoA synthetase)、碳酐酸酶(carbonic anhydrase)、Bud 10蛋白(Bud 10 protein)、类驱动蛋白bimC(kinesin-related protein bimC)、锌指蛋白ASD4(zinc finger protein ASD4)、转录起始因子TFIID(transcription initiation factor TFIID)、角质酶G-box结合蛋白(cutinase G-box binding protein)、吖啶黄素敏感性控制蛋白(acriflavine sensitivity control protein ACR-2)、核类VCP蛋白(nuclear VCP-like protein)、热激蛋白HSP30(heat shock protein 30)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、2C型蛋白磷酸酶(type 2C protein phosphatase)、核糖核酸外切酶(exoribonuclease)、硒蛋白(selenoprotein)、DNA聚合酶η(DNA polymerase eta)、存活因子1(survival factor 1)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)等22个已知功能蛋白和16个未知功能蛋白。部分突变基因,如锌指蛋白ASD4、角质酶G-box结合蛋白、寡肽转运蛋白和2C型蛋白磷酸酶等,已分别在稻瘟病菌、稻曲病菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰孢菌等植物病原真菌中证实为致病相关基因。多种类型致病相关突变体的获得,为深入研究甘蔗镰孢菌致病分子机理提供了新的材料。

海洋黏细菌防治甘蔗梢腐病的筛选评价

【目的】明确来源于广西北部湾的海洋黏细菌对甘蔗梢腐病病原真菌的生物防治潜力,为研发有效防治甘蔗梢腐病的生物农药提供科学依据和物质基础。【方法】以来源于广西北部湾不同海洋生境的12种62株黏细菌为研究对象,以2株广西蔗区甘蔗梢腐病优势病原菌甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)9DF-3-2和FS-2-1为靶标,通过平板对峙培养法评价黏细菌对甘蔗镰孢菌的拮抗作用,初步筛选出潜力活性菌株;利用透析膜对峙培养法、菌丝裂解法和菌丝生长速率法等从拮抗作用方式、对病原菌菌丝生长的影响等方面评价潜力活性菌株对甘蔗镰孢菌的生物防治潜力。【结果】通过平板对峙培养法从62株黏细菌中发现47株黏细菌对2株甘蔗镰孢菌9DF-3-2和FS-2-1具有明显的抑制作用,其活性菌株率达75.8%,有18株黏细菌对2株甘蔗镰孢菌的抑菌直径大于1.000 cm,其中以叶柄黏球菌(Myxococcusstipitatus)T163和蜂窝囊菌(Melittangiumsp.)T269的抑制作用最强。黏细菌胞外发酵液对甘蔗镰孢菌菌丝裂解试验结果显示,黏细菌T163和T269的胞外发酵液对2株甘蔗镰孢菌的菌丝抑制作用最明显;透析膜平板隔离试验结果显示,黏细菌T269、T163和T071受透析膜隔离后对甘蔗镰孢菌仍具有很好的抑制作用;黏细菌发酵提取物抗菌活性测定结果显示,黏细菌T163和T269的发酵提取物对2株甘蔗镰孢菌均具有较好的抑制作用,其中浓度为100.0μg/mL的T163发酵提取物的抑菌活性最好,其对9DF-3-2和FS-2-1的抑制中浓度(EC50)分别为13.97和84.58μg/mL。【结论】来源于广西北部湾的海洋黏细菌T163和T269对甘蔗梢腐病病原菌甘蔗镰孢菌表现出较好的生物活性,具有开发成绿色生物防治剂的潜力。

甘蔗镰孢菌碳水化合物结合模块效应基因Fs11724的分离鉴定及功能分析

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起毁灭性病害甘蔗梢腐病(sugarcane pokkah boeng disease, PBD)的主要病原菌之一。病原菌分泌的效应蛋白在病原与植物互作中发挥至关重要的作用。本研究基于课题组前期甘蔗镰孢菌全基因测序数据,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到一个新的含CBM4;结构域的效应蛋白基因,并对其功能进行了初步探索。序列分析表明Fs11724基因开放阅读框822 bp,编码273个氨基酸,分子量为28.24 kDa,理论pI值为4.29,亲水性平均系数–0.072,属于亲水性分泌蛋白;通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统证实Fs11724抑制由BAX诱导的细胞程序性死亡,表明Fs11724具有潜在抑制寄主防御反应的毒性功能;同时,利用酵母分泌系统对其编码蛋白信号肽的分泌功能进行验证,确定该基因编码蛋白为典型分泌蛋白;qRT-PCR结果分析表明Fs11724在甘蔗镰孢菌侵染前、后期上调表达,表达量在168 hpi达到峰值。该研究表明Fs11724编码蛋白为甘蔗镰孢菌F. sacchari的一个效应蛋白,其信号肽具有分泌功能,并且可以在非寄主植物烟草上抑制BAX诱导的细胞坏死,在真菌侵染植物过程中显著表达,可能在调控植物免疫反应中发挥作用。研究结果为进一步研究病原–甘蔗互作,揭示甘蔗镰孢菌发病机制奠定基础。

甘蔗镰孢霉与工业用酶制剂对三七茎叶有效成分转化作用的比较

采用生物技术对三七的种植废弃物——三七茎叶中的抗肿瘤成分人参皂苷化合物K(C-K)进行转化。比较β-葡聚糖苷酶、纤维素酶和甘蔗镰孢霉(Fusarium sacchari)对三七茎叶废弃物中总皂苷的转化作用,以C-K为检测目标,优选转化活性强、C-K生成量高的转化方法。结果表明,三七茎叶经甘蔗镰孢霉转化后,C-K的产量是原皂苷中含量的215倍,是经β-葡聚糖苷酶转化的2.3倍、纤维素酶转化的3倍。

5种杀菌剂对井冈山毛竹菱斑病的室内毒力试验

采用生长速率法,对毛竹菱斑病的5种病原真菌进行了室内毒力试验,结果显示,福美双和农抗120对该病的病原菌无明显抑制效果,多菌灵和甲基立枯灵对尖孢镰刀菌、甘蔗节菱孢菌、赤霉病菌和炭角菌属菌均有较好的抑制效果,而噁霉灵对链格孢菌具有中等强度的抑制效果。

甘蔗镰孢菌FsANT基因的克隆及表达模式分析

甘蔗是我国主要的糖料作物,是生产蔗糖最主要的原料,甘蔗生产过程中受到的病虫害威胁给蔗糖产业造成了严重的损失。甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)引起的梢腐病是一种真菌性病害,严重影响甘蔗作物生产。镰孢菌致病基因的研究对于梢腐病的防治具有重要意义。腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase, ANT)介导线粒体与细胞质基质之间ADP/ATP的交换,在真核细胞能量代谢中发挥重要作用,与细胞的生长、发育和凋亡密切相关。本研究克隆获得了长936 bp具有完整开放阅读框(open reading frame, ORF)的甘蔗镰孢菌ANT基因序列,命名为FsANT,其编码311个氨基酸,并且与小麦条锈菌病原菌ANT蛋白和小麦白粉病病原菌ANT序列相似性较高。蛋白软件分析显示,该基因编码的蛋白为稳定的疏水蛋白,含有5个跨膜结构,一个ADP/ATP transporter结构域,有3个同源重复的MCF基序,与粒体转运蛋白家族(mitochondrial carrier family,MCF)的基本结构特点相吻合。软件预测分析发现FsANT基因可能定位在线粒体。qRT-PCR结果显示,FsANT基因在菌丝生长时期的表达相对稳定无显著差异;在与甘蔗互作过程的表达模式表现为:接种后12 h该基因开始上调表达,24 h表达量显著升高,72 h达到表达高峰。推测FsANT基因的表达不仅与甘蔗镰孢菌细胞的生长相关,同时可能参与F. sacchari与甘蔗的互作过程,且主要在侵染后期发挥功能。研究病原菌生长保守基因为甘蔗抗梢腐病育种提供新思路。

甘蔗镰孢菌β-酮酯酰-辅酶A还原酶基因FsKCR1功能研究

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)引起的甘蔗梢腐病严重影响了甘蔗的产量和质量。编码β-酮酯酰-辅酶A还原酶(β-ketoacyl-CoA reductase, KCR)的基因与脂肪酸合成有关,并为生物体提供超长链脂肪酸。本文对甘蔗镰孢菌KCR的相关基因FsKCR1侵染阶段的表达模式进行了分析,利用同源重组与基因互补的方法获得敲除突变体和互补菌株,同时对上述菌株的主要生物学特性进行研究。与野生型菌株FF001和互补菌株Com-△FsKCR1相比,敲除突变体△FsKCR1的生长速率、小型分生孢子产量和萌发速率以及致病力均显著降低。此外,缺失FsKCR1导致菌丝体疏水性下降。脂肪酸组分分析表明,FsKCR1参与调控甘蔗镰孢菌超长脂肪酸的合成。本研究结果为深入解析甘蔗镰孢菌致病机制提供重要依据。

甘蔗镰孢菌质子偶联寡聚肽转运蛋白基因FsPTR2E的功能研究

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起甘蔗梢腐病的主要病原菌之一,明确其致病机理对于探寻甘蔗梢腐病防治策略具有重要意义。质子偶联寡聚肽转运蛋白由质子移动力提供能量,转运二肽、三肽等氮源,在生物体生长发育过程中发挥着至关重要的作用。本文对F.sacchari中一个与质子偶联寡聚肽转运蛋白编码基因高度同源的基因FsPTR2E在病菌大型分生孢子形成过程及侵染阶段的表达模式进行分析,同时对FsPTR2E敲除突变体(ΔFsPTR2E)的主要生物学特性进行研究。结果表明,1)同在常规培养基(PDA)上相比,F.sacchari在大型分生孢子诱导培养基上培养24~72 h,FsPTR2E的表达量显著升高;2)F.sacchari侵染寄主72 h时,FsPTR2E的表达量和菌丝阶段相比显著下降;3)敲除FsPTR2E不影响病菌生长、孢子萌发以及对逆境胁迫的响应,但是敲除突变体ΔFsPTR2E的大型分生孢子和小型分生孢子的产量和野生型菌株相比均显著降低;4)ΔFsPTR2E的致病力较野生型菌株显著增强;5)同野生型菌株一样,ΔFsPTR2E可以在以二肽为唯一氮源的培养基上正常生长。这些结果表明FsPTR2E参与了F.sacchari的产孢与致病过程,但可能不负责二肽转运。