新型大肠杆菌融合表达系统表达水蛭素Ⅲ基因研究

选用大肠杆菌Ｌ－门冬酰胺酶（ＡＳＰｓⅡ）高效表达质粒ｐＫＡ作为融合表达载体，将水蛙素Ⅲ（ＨＶ３）人工合成编码基因插入 ｐＫＡ质粒的 ＡＳＰｓⅡ编码基因 ａｎｓＢ中，使 ＡＳＰｓ Ⅱ１Ｎ端的 ８９个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与 ＨＶ３形成融合蛋白，从而构建成 ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白表达质粒 ｐＫＡＨ，通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原长更换成 ｐＵＣ高拷贝数复制原点，进而构建成ＡＳＰｓⅡ－ＨＶ３融合蛋白高效表达载体 ｐＵＫＡＨ。该质粒在大肠杆菌 ＪＭ１０５宿主细胞中表达后，融合蛋白（１５． ６ ｋＤ）占细菌总蛋白 １０ ５％，该融合蛋白经 ＣＮＢｒ切割释放出活性水蛭素分子，抗凝血活力达约 ２０ ＡＴＵ／ｍｌ培养液，为以后进一步研究打下了基础。

抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合。该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础。

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

hVEGF_(165)和嵌合水蛭肽融合基因的真核表达载体的构建及其表达

目的:克隆hVEGF165和嵌合水蛭肽(fused hirudin,FH)融合基因,构建hVEGF165-FH/pcDNA3.0基因表达载体,并在人内皮细胞株中表达。方法:分别通过PCR法扩增hVEGF165和引物退火法合成FH基因,将融合基因插入表达载体pcD-NA3.0,构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0。对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,将正确克隆的质粒分别作体外快速转录翻译鉴定,以及经脂质体介导转染人内皮细胞株,并对表达产物进行鉴定。结果:hVEGF165和FH成功融合,形成711 bp的目的片段,并成功构建重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0,重组质粒转染人内皮细胞株有hVEGF165-FH表达。结论:重组质粒hVEGF165-FH/pcDNA3.0在人内皮细胞株中得到表达,为其融合蛋白活性研究及基因治疗打下良好基础。

重组水蛭素相关肽Hi-lys的表达与纯化(英文)

为开发一种新的有临床应用价值的抗血栓药物,根据水蛭素保持抗凝活性的2 0肽片段,设计并构建了水蛭素相关肽(Hi lys)与天冬酰胺酶C端的融合表达系统.为方便目的肽与融合伙伴的分离,增加了富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)及酸敏感的天冬氨酰 脯氨酸(Asp Pro)位点,获得了表达质粒pED P8 Hi lys.将其转化E .coliBL 2 1,玉米浆培养基(kanr)培养,乳糖诱导获得融合蛋白(AnsB C P8 Hi lys)的高效表达.通过细菌裂解、包涵体洗涤、尿素溶解、乙醇沉淀、酸水解和DEAE 纤维素5 2柱层析纯化获得目的肽Hi lys ,用凝血酶测定法测得其抗凝活性为5 0ATU mg .

hVEGF_(165)和嵌合水蛭肽融合基因的构建、表达和活性检测

根据抗PTCA或支架后再狭窄的基因治疗需要多基因治疗的特点,用基因重组技术构建了hVEGF165和嵌合水蛭肽(fusedhirudin,FH)融合基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,通过脂质体介导将pcDNA3.0/hVEGF165-FH转染到人内皮细胞株(ECV304)中,RT-PCR及蛋白质印迹证明融合基因hVEGF165-FH在ECV304细胞中得到表达(分子质量为24ku左右).通过体外活性检测——MTT法检测hVEGF165-FH对ECV304细胞增殖的影响,通过体外血管生成分析hVEGF165-FH对内皮细胞株ECV304增殖的影响.通过体外抗栓活性检测,表明表达产物具有促进内皮细胞株增殖及加快血管生成的作用,同时显著抑制了ADP诱导的血小板聚集率(P<0.05)并显著延长APTT和TT(P<0.05).实验结果表明,融合基因在内皮细胞株中得到表达,表达的融合蛋白具有hVEGF165和嵌合水蛭肽(FH)的双重活性,这为以后的融合基因治疗再狭窄的动物实验打下了良好基础.