牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

基于融合特征与GA-SVM算法的脑疾病基因预测

单一生物数据网络提供的特征信息是十分受限的,针对这一问题,提出了一种基于半监督自编码器的多网络特征融合方法,丰富特征信息。此外,为解决在人为设置模型的超参数时,易出现模型性能较低、陷入局部最优等问题,进一步提出了利用遗传算法优化支持向量机(GA-SVM算法)模型的方法,提高脑部疾病基因的预测性能。构建来自不同数据源的相似性数据网络,利用重启随机游走算法从四个数据网络中提取特征,通过半监督自编码器进行处理及融合,在十折交叉验证的策略下使用GA-SVM算法模型预测脑部疾病基因,并与其他算法进行比较。实验结果表明,在PD数据集上的AUC和AUPR值分别为0.805、0.792,而在MDD数据集上的AUC和AUPR值分别为0.825、0.823,均优于已有的预测模型,有效证明了该方法能够提高脑部疾病基因的预测效果。

黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤BCL-10蛋白表达及其与API2-MALT1融合基因的关系

目的探讨MALT淋巴瘤中BCL-10蛋白核表达与AP12-MALT1融合基因的关系。方法对86例MALT淋巴瘤进行回顾性研究,采用SP法检测BCL-10的表达,RT-PCR检测AP12- MALT1融合基因。结果10例桥本甲状腺炎均表达BCL-10于胞浆,86例MALT淋巴瘤患者中,42例(48．8％)同时表达BCL-10于胞核和胞浆,35例(40．7％)检测出AP12-MALT1融合基因。BCL-10核表达的检出与AP12-MALT1融合基因具有相关性(r=0．374,P=0．000)。结论MALT淋巴瘤中BCL-10蛋白的核表达与AP12-MALT1融合基因相关。

结核杆菌CFP-10／ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的构建结核分枝杆菌H37Rv株esat．6-cfp-10（简称ec）融合基因及其原核表达载体pET-23b（＋）．esat．6-cfp-10[以下简称pE％23b（＋）-ec]，表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10（简称rEC），并分析其免疫反应性。方法采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-IO编码基因用疏水甘氨酸接头（Gly4Ser），进行PCR扩增融合。构建TA克隆载体pMDR19-T-esat-6-cfp-10（简称pMD-19-T-ec），利用PCR、酶切和测序进行鉴定。经限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切后将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b（＋）。将构建正确的重导组质粒pET-23b（＋）-ec转化E-coliBL21（DE3）pLysE，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPm）诱导rEC的表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法分析其表达情况。用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。用Western印迹初步评价融合蛋白的免疫反应性。结果融合基因及其原核表达载体构建成功，融合蛋白以可溶性非包涵体形式表达，相对分子质量为21000，表达量约占菌体总蛋白的35％。经亲和层析后得到了纯度达97．2％的融合蛋白。Western印迹证实，融合蛋白能与确诊的肺结核患者血清发生特异性免疫应答。结论成功构建了原核表达载体pET-23b（＋）-ec，获得了rEC融合蛋白，为rEC融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。