RNA干扰下调FXR1基因表达对卵巢癌细胞系A2780生物学功能的影响

目的:研究下调脆性X染色体相关基因1(fragile X-related gene1,FXR1)表达对卵巢癌细胞系A2780生物学行为的影响。方法:将针对FXR1的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体转染A2780细胞,经G418进行筛选获得稳定转染株,检测RNA干扰后细胞生长、增殖、黏附、体外迁移及侵袭能力,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡情况。结果:RNA干扰(RNA interference,RNAi)下调FXR1基因表达后A2780细胞生长速度、增殖能力受抑制,但对A2780细胞体外侵袭、迁移能力、基质黏附能力及凋亡无影响。结论:RNAi抑制FXR1基因的表达可抑制卵巢癌A2780细胞的生长及细胞增殖。

智力低下相关蛋白(FXR1P)与CMAS相互作用的生物学效应研究(英文)

脆性X综合征(FXS)是一种遗传性智力低下疾病,其发病率仅次于21三体综合征.脆性X智力低下蛋白(FMRP)是FXS的关键性致病因子,该蛋白由脆性X智力低下基因1(FMR1)编码所得.FMR1在神经肌肉和睾丸组织中广泛表达.脆性X相关蛋白1(FXR1P)则是由FMR1的同源基因脆性X相关基因1(FXR1)编码所得,并且与蛋白质和RNAs之间存在着相互作用.许多疾病都涉及到FXR1表达的改变.为了了解FXR1P与CMAS(胞嘧啶单核苷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶)相互作用所产生的的生物学效应,我们构建了FXR1的过表达载体,并观察其在PC12细胞(大鼠鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)和VSMC(血管平滑肌细胞)中的表达以及继而对于细胞形态和CMAS活性相关的许多细胞指标的效应.我们证实,FXR1基因的过表达可以提高PC12细胞中CMAS的活性,并对于该类细胞的生长提供一定程度的保护作用.PC12细胞是一种较为常见的用于研究神经系统疾病的细胞系.结论:我们推测FXR1P是一个组织特异调节因子,可以改变PC12细胞而非VSMC细胞中神经节苷酯(GM1)的浓度.

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源:胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMAS)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)、高尔基体自身抗原golgina亚类4(GOLGA4)、17-β羟类固醇脱氢酶1(HSD17B1)、绒毛膜生长催乳激素1(CSH1)。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。

FXR1基因过表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究

背景与目的:前期研究显示,FXR1基因是从卵巢上皮癌cDNA文库中筛选到的相关抗原基因,FXR1抗原蛋白的自身抗体可用于早期卵巢癌的诊断。本研究的目的是分析上调上皮性卵巢癌相关抗原基因FXR1表达对卵巢癌细胞系HO8910生物学行为的影响。方法:采用半定量RT-PCR法检测在不同卵巢组织中,FXR1 mRNA的表达,并分析其与临床病理的关系。RT-PCR扩增FXR1 CDS,构建FXR1真核表达载体,脂质体介导下转染HO8910细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:FXR1 mRNA在卵巢癌组织中的相对表达水平比卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织均增高(P<0.05);FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期和高分化癌组织中FXR1 mRNA相对表达水平低于Ⅲ期和中-低分化组织(P<0.05);成功构建了FXR1基因的真核表达载体,并稳定转染了HO8910细胞。生长曲线显示上调FXR1基因表达可促进细胞的生长;克隆形成实验显示上调FXR1基因表达可促进细胞增殖。基质黏附实验显示,上调FXR1基因表达可加强细胞对基质的黏附能力,流式细胞周期检测亦发现与对照(80%)相比,转染FXR1基因后G1期细胞(67.1%)比例明显减少,这说明转染FXR1后细胞的增殖更旺盛。同时发现FXR1对细胞侵袭、迁移的能力无明显影响。结论:上调FXR1基因表达可能有促进卵巢癌细胞的生长、增殖、加强细胞对基质黏附能力的作用。

FMRP蛋白6种异构体与FXR1蛋白间的相互作用

脆性Ｘ综合征是最常见的遗传性智力低下疾病，其致病基因ＦＭＲ１存在复杂的选择剪接．ＦＭＲ１基因的功能及其选择剪接的生物学意义尚未阐明．ＦＭＲ１蛋白（ＦＭＲＰ）与脆性Ｘ相关蛋白１（ＦＸＲ１）可形成异源二聚体．采用酵母双杂交体系研究了由ＦＭＲ１第１２、１４、１５外显子不同选择剪接方式产生的６种ＦＭＲＰ异构体与ＦＸＲ１蛋白的相互作用，以期从蛋白质相互作用的角度探讨ＦＭＲ１基因选择剪接表达的生物学意义．结果表明各种异构体与ＦＸＲ１相互作用的强度随异构体蛋白肽链长度的增长而减弱．外显子１２、１４、１５的选择剪接虽然不能开关式控制ＦＭＲＰ与ＦＸＲ１的相互作用，但其Ｃ端亲水区在一定程度上影响相互作用的强弱．提示选择剪接对ＦＭＲＰ与ＦＸＲ１异源二聚体的稳定性产生影响．

卵巢上皮性癌相关抗原基因FXR1的表达及其临床价值

目的：探讨FXR1基因在卵巢上皮性癌中的表达及其临床价值。方法：用RT-PCR法检测FXR1基因在36例卵巢上皮性癌、15例卵巢良性肿瘤、13例正常卵巢组织中的表达。结果：FXR1基因在卵巢上皮性癌（0.915±0.6883）、良性肿瘤（0.5778±0.4785）、正常组织（0.2855±0.2335）中均有一定程度表达。癌组织中的相对表达水平高于良性卵巢肿瘤,但差异无统计学意义（P〉0.05）;癌组织中的FXR1基因相对表达水平高于正常组织（P〈0.05）;良性卵巢肿瘤组织中的相对表达水平高于正常卵巢组织（P〈0.05）;手术—病理分期为Ⅰ-Ⅱ期癌组织中的FXR1基因相对表达水平低于Ⅲ期（P〈0.05）;高分化癌组织中的FXR1基因相对表达水平低于中—低分化癌组织（P〈0.05）。结论：FXR1基因的表达可能与卵巢上皮性癌相关,可能在卵巢上皮性癌的发生、发展过程中起一定作用。

FXR1P相互作用RNA的研究

目的:本研究利用酵母三杂交系统从人脑海马回cDNA文库中筛选FXR1P的靶RNA,以进一步阐明FXR1基因的功能。方法:将表达FXR1P全长的质粒pYESTrp3/FXR1转化酵母菌株L40ura3/pHybLex/Zeo-MS2,检测毒性和自激活性;应用酵母三杂交技术从人脑海马回pRH3′-cDNA文库中筛选FXR1P的相互作用RNA;分离初步筛选的结果,再次转化含有诱饵质粒的融合菌株L40ura3/pHybLex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,重新验证阳性结果;最后对阳性结果的外源插入片段进行测序和生物信息学分析。结果:酵母三杂交的筛选得到了3个阳性结果,经过测序和同源性分析,其中一个阳性结果中的插入片段为K-ALPHA-1 mRNA的部分序列。结论:K-ALPHA-1 mRNA可能是一种新的FXR1P的靶RNA。

Circ_VANGL1调控miR-493-5p/FXR1影响结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

背景circRNA在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)组织、细胞系和血浆中异常表达,与CRC临床恶性特征密切相关,但CRC中环状RNA VANGL1(circular RNA VANGL1,circ_VANGL1)的表达及其功能机制仍不清楚.假设circ_VANGL1通过微小RNA(microRNA,miR)-493-5p/脆性X相关基因1(fragile X-related gene 1,FXR1)轴影响CRC细胞的增殖、迁移和侵袭.目的探讨circ_VANGL1调控miR-493-5p/FXR1对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法Western blot检测FXR1在CRC组织和癌旁组织中表达.RT-qPCR检测circ_VANGL1和miR-493-5p表达.体外培养CRC细胞Caco-2,将其分为si-circ_VANGL1组、si-NC组、miR-NC组、miR-493-5p mimic组、si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor组.细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和克隆形成实验评估Caco-2增殖能力.Transwell实验评估Caco-2迁移和侵袭能力.双荧光素酶报告实验检测RNAs(circ_VANGL1和miR-493-5p、miR-493-5p和FXR1)之间的相互作用.结果与癌旁组织比较,CRC组织中circ_VANGL1相对水平、FXR1蛋白表达显著升高(P<0.05),miR-493-5p相对水平显著降低(P<0.05).与si-NC组比较,si-circ_VANGL1组Caco-2细胞抑制率、miR-493-5p相对水平显著升高(P<0.05),FXR1蛋白表达、克隆形成数、迁移数、侵袭数显著降低(P<0.05).与miR-NC组比较,miR-493-5p mimic组Caco-2细胞抑制率显著升高(P<0.05),FXR1蛋白表达、克隆形成数、迁移数、侵袭数显著降低(P<0.05).circ_VANGL1直接与miR-493-5p结合.与si-circ_VANGL1组比较,si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor组Caco-2细胞抑制率显著降低(P<0.05),FXR1蛋白表达、克隆形成数、迁移数、侵袭数显著升高(P<0.05).结论沉默circ_VANGL1通过靶向miR-493-5p/FXR1轴抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭.

FXR1自身抗体在卵巢癌的诊断价值

目的:评价卵巢癌相关抗原FXR1自身抗体在卵巢癌诊断中的临床价值。方法:用间接ELISA法检测126例卵巢癌、42例良性卵巢肿瘤、142例正常女性血清中卵巢癌相关抗原FXR1自身抗体的相对含量,受试者操作曲线(receive operating char-acteristic curve,ROC)判定临界值,IRMA检测血清中CA-125的含量,分析自身抗体及自身抗体与CA-125联合检测在卵巢癌诊断中的价值。结果:3组血清中均检测到FXR1自身抗体,FXR1抗原IgG型(42.9%,19%,11.2%)、IgM型(39.7%,26.2%,7.7%)自身抗体在癌血清中的阳性率高于良性肿瘤及正常血清(P<0.05);良性肿瘤中IgG型自身抗体的阳性率高于正常对照(P<0.05),IgM型自身抗体的阳性率虽高于正常对照,但差异无统计学意义(P>0.05)。IgG型I、gM型自身抗体单独检测及联合检测时在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者中的阳性率均高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)。IgG型I、gM型自身抗体联合检测在卵巢癌血清中的阳性率高于良性肿瘤及正常对照血清(61.1%,26.2%,11.2%)(P<0.05);良性肿瘤中的阳性率高于正常对照(P<0.05)。IgG、IgM型自身抗体联合检测时诊断卵巢癌的阳性率与CA-125相同(61.1%),在Ⅰ～Ⅱ期为80.9%与51.1%。当IgGI、gM型自身抗体与CA-125联合检测时诊断卵巢癌的阳性率高于CA-125(84.9%与61.1%,P<0.05)。结论:卵巢癌相关抗原FXR1自身抗体有可能可用于卵巢癌的早期诊断,是CA-125的重要辅助血清标志物。

IQCE mRNA与FXR1P在酵母三杂交体系中的相互作用

脆性X相关基因1编码蛋白FXR1P是一种RNA结合蛋白,其所结合的靶RNA目前所知甚少。本研究应用酵母三杂交技术对本课题组从pRH3-cDNA人脑海马RNA表达文库中筛选到的一种可能与FXR1P存在相互作用的RNA IQCE进行研究,以验证该RNA与FXR1P的相互作用。方法为:提取利用酵母三杂交技术初步筛选得到的酵母阳性克隆的质粒,转化大肠杆菌Top10,利用其质粒不相容性分离插入了目的片段的pRH3′-cDNA质粒,将该质粒转化入含目的基因FXR1的酵母菌株L40-ura3/pHyb lex/Zeo-MS2/pYESTrp3/FXR1,进行一对一的酵母三杂交验证,最后将该片段进行测序。测序结果为IQCE的一段编码序列,而目前尚无研究报导FXR1与IQCE的相互关系。结论:提示FXR1P与IQCE mRNA存在相互作用,IQCE可能是FXR1P发育调控网络组成成员之一。

FXR1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人脆性X相关基因1(FXR1)的真核表达载体pCMV-HA,为研究FXR1P互作蛋白奠定基础。方法以pYESTrp3-FXR1为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增FXR1基因片断,将扩增片段经EcoR I和XhoI双酶切后克隆到pCMV-HA载体,酶切鉴定阳性克隆并测序鉴定。结果成功构建了pC-MV-HA/FXR1真核表达载体。结论pCMV-HA/FXR1真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1互作蛋白奠定了基础,从而对研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理具有深远意义。

Phase Separation of FXR1 Activates Dormant mRNAs and Drives Sperm Development

Chinese researchers pinpoint an RNA-binding protein called FXR1 to be the key to wake up the dormant mRNAs required for late sperm maturation in mice,which may shed light on how to reverse male infertility in humans.

Anti-miR-132通过结合FXR1减轻PTSD大鼠焦虑及抑郁样行为的实验研究

目的 探讨miR-132是否通过结合脆性X染色体相关基因1(FXR1)从而上调大鼠杏仁核神经元突触后致密蛋白-95(PSD95)表达水平,以改善创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠的焦虑样及抑郁样行为。方法 采用单程长时应激(SPS)制备PTSD大鼠模型,通过向大鼠右侧侧脑室注射慢病毒建立miR-132基因沉默的PTSD大鼠模型。将PTSD模型大鼠分为PTSD组、sh-miR-NC组和sh-miR组,正常大鼠作为对照组(Control组);RT-q PCR及Western blot检测正常组大鼠和PTSD组大鼠杏仁核miR-132及FXR1的水平;旷场实验、强迫游泳实验检测miR-132基因沉默对PTSD大鼠焦虑样及抑郁行为的影响。行为学实验后取材各组大鼠杏仁核,利用Western blot检测PSD95蛋白表达情况。双荧光素酶报告分析显示miR-132是否与FXR1存在结合位点。结果 PTSD组大鼠杏仁核miR-132水平显著高于对照组,而FXR1蛋白表达水平显著降低;miR-132基因沉默显著减轻PTSD模型大鼠的焦虑样及抑郁样行为;Western blot结果显示:PTSD组大鼠杏仁核神经元PSD95蛋白表达显著低于对照组,miR-132基因沉默显著升高PTSD组大鼠杏仁核神经元PSD95蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-132与FXR1结合。结论 miR-132通过FXR1介导杏仁核神经元PSD95水平上调,从而显著减轻PTSD大鼠的焦虑及抑郁样行为。

FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的:构建携带人脆性X相关基因1(Fragile X related genel,FXR1)与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的融合表达载体并进行表达,为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础。方法:以重组质粒pYESTrp3/FXR1为模板,PCR扩增FXR1基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP-N1/FXR1,并用脂质体法转染人胚肾细胞,荧光显微镜下观察GFP在细胞内的表达及Western Blotting检测FXR1的表达情况。结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/FXR1,在人胚肾细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP/FXR1。结论:本实验成功构建EFGP和FXR1重组共表达载体并可在真核细胞中表达,为进一步研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理奠定基础。

乙型肝炎病毒感染患者血清中病毒拷贝数、肝功能与FXR1蛋白的相关性分析

探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染患者血清中FXR1蛋白(fragile X-related gene 1)与血清中病毒拷贝数(HBV-DNA)、肝功能指标的关系,为HBV感染患者临床诊疗提供依据。方法:选取2018年7月至2019年4月在江南大学附属医院(无锡市第四人民医院)就诊的HBV血清病毒载量(HBV-DNA)>1000copies/mL的乙肝患者(HBV-DNA阳性,HBV-DNA+)85例。同时选取非HBV感染患者(HBV-DNA-)32人为对照组。通过ELISA方法检测患者血清中FXR1蛋白浓度,通过罗氏cobas c702全自动生化分析仪分析患者肝功能指标,统计分析FXR1蛋白浓度与患者血清HBV-DNA及其肝功能指标的关系。结果:HBV DNA+患者血清中FXR1浓度(46.61 ± 2.55 pg/mL)显著高于HBV-DNA-患者的血清FXR1浓度(36.19 ± 3.66 pg/mL)(P<0.05)。取HBV-DNA+患者血清FXR1蛋白浓度平均值,将HBV-DNA+患者分为低浓度组(FXR1浓度≤46.61pg/mL)和高浓度组(FXR1浓度>46.61 pg/mL),低浓度组患者血清HBV-DNA((4.93 ±1.03)×107copise/mL)略高于高浓度组患者血清HBV-DNA((1.21 ±0.43)×107 copise/mL),差异无统计学意义(P=0.081);两组患者的肝功能指标均无显著性差异(P>0.05)。相关性分析显示,HBV-DNA+患者血清中FXR1浓度与HBV-DNA载量显著相关(P<0.05),而与肝功能指标无相关关系。结论:乙肝患者血清中HBV-DNA与FXR1蛋白浓度呈显著相关关系,但是,FXR1蛋白水平与患者肝功能指标无明显关系。

miR-132基因沉默改善PTSD大鼠焦虑样行为与上调FXR1表达相关

目的研究创伤后应激障碍(PTSD)大鼠前额叶皮质脆性X染色体相关基因1(FXR1)的表达变化,探讨miR-132基因沉默对PTSD大鼠焦虑样行为的影响。方法采用单程长时应激(SPS)制备PTSD大鼠模型,通过侧脑室注射慢病毒建立miR-132基因沉默的PTSD大鼠。将大鼠分为4组:正常组、PTSD组、sh-miRNC组和sh-miR组,通过旷场实验和高架十字迷宫实验检测miR-132基因沉默对PTSD大鼠焦虑样行为的影响。取材各组大鼠前额叶皮质,利用免疫荧光染色、Western blot检测FXR1蛋白表达情况。结果与正常对照组大鼠相比,PTSD组大鼠有显著的焦虑样行为,miR-132基因沉默显著减轻大鼠的焦虑样行为。与正常对照组大鼠相比,PTSD组大鼠前额叶皮质FXR1蛋白表达水平显著降低,而miR-132基因沉默显著上调FXR1蛋白表达水平。结论miR-132基因沉默显著减轻PTSD大鼠的焦虑样行为与上调FXR1表达水平相关。

结构域酵母三杂交诱饵载体的构建及酵母转化

目的脆性X相关蛋白(FXR1P)是一种RNA结合蛋白,本研究构建了其N-端结构域、KH结构域的酵母三杂交诱饵载体并转化酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2,为筛选这2种结构域的相互作用RNA作基础。方法根据Genebank提供的序列设计引物,以pYESTrp3/FXR1质粒作为模板,扩增分别包含FXR1P N-端结构域、KH结构域的编码区序列,连接到用于酵母三杂交文库筛选的pYESTrp3质粒,得到诱饵质粒,导入大肠杆菌Top10扩增,筛选阳性克隆并提取其中的重组质粒,再转化酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2。结果经过测序验证,该重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主菌无毒性,无自激活现象。结论成功构建了能用于酵母三杂交文库筛选的FXR1P蛋白N-端结构域、KH结构域酵母三杂交诱饵载体,为研究这两个结构域的RNA结合功能奠定了基础。

FXR基因家族

FXR基因家族是与脆性X综合征发病相关的一个基因家族。有3个家族成员。在进化上高度保守，氨基酸序列高度相似，有共同的功能结构域：两个KH结构域、RGG盒、NES和NLS。能够与RNA和多聚核糖体结合。通过NES和NLS携带其mRNA在细胞核和细胞质之间穿梭。不同的蛋白亚型其组织分布各异。该家族成员在大脑和神经发育过程中发挥重要作用，影响认知过程和智力发育。

microRNA在脆性X综合征发病机制中的研究进展

脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是最常见的遗传性认知障碍疾病,也是一种与自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)相关的严重的基因疾病.它主要是由于脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation 1,FMR1)的异常扩增及其上游Cp G岛的异常甲基化,导致其编码的脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)表达减少或缺失引起的.FMRP与miRNA(micro RNA)均具有翻译抑制活性,而且FMRP在生物化学和遗传学上均与miRNA调控通路有相互作用.此外,越来越多的研究发现miRNA调控通路在FXS的发病和治疗中发挥作用.因此,本文对miRNA的功能及其与脆性X蛋白家族成员间的相互作用进行阐述,为在miRNA水平了解FXS的发病机制奠定基础.

脆性X相关蛋白Ⅰ的研究进展

脆性X相关基因I(FXR1)发现于1995年,位于3号染色体3q28。其产物脆性X相关蛋白1(FXR1P)与脆性X智障蛋白1 (FMR1P)、脆性X相关蛋白2(FXR2P)形成一个RNA结合蛋白家族。目前认为这三种蛋白能输送mRNA分子并调控其翻译过程。FXR1的翻译产物(FXR1P)分子中存在两个KH结构域和一个RGG结构域,这两种结构域与FXR1P分子的RNA结合作用有关。FXR1P的表达具有较高的组织特意性,在横纹肌中表达最高。合适的动物模型对于一种蛋白的功能研究具有十分重要的意义,目前,FXR1敲除的各种动物模型如小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的近亲Xenopus tropicalis已经在不同的实验室建立。本文主要介绍了FXR1P的结构特点、功能及其实验动物模型。