褪黑素对类风湿关节炎病人外周血淋巴细胞增殖反应的影响及其G蛋白-cAMP信号转导机制的研究

目的研究褪黑素（ＭＴ）对类风湿关节炎（ＲＡ）病人外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）增殖反应的影响及其Ｇ蛋白ｃＡＭＰ信号转导机制。方法淋巴细胞增殖法、ｃＡＭＰ放免测定及Ｇ蛋白功能分析。结果ＲＡ病人ＰＢＬ增殖能力低于正常人１０倍左右，ＭＴ在１×１０－８～１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１能明显促进ＲＡ病人ＰＢＬ的增殖反应；ＲＡ病人ＰＢＬ的ｃＡＭＰ水平明显高于正常人，ＭＴ（１×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１）可部分使其降低，且ＭＴ的这一作用能被百日咳毒素（ＰＴ）取消。结论ＭＴ可促进ＲＡ病人ＰＢＬ的增殖反应。

缺氧条件下梭曼中毒大鼠脑G蛋白及cAMP-PKA信号系统的变化

目的 探索Ｇ蛋白及ｃＡＭＰ－ＰＫＡ信号系统在缺氧条件下梭曼毒性升高机制中的作用。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 Ｇｉα、Ｇｑα含量，放射免疫测定 ｃＡＭＰ浓度及酶放射化学分析测定ＰＫＡ活性。结果 梭曼中毒、单一缺氧损伤和缺氧复合梭曼中毒大鼠脑组织 Ｇｑα含量、ｃＡＭＰ浓度及 ＰＫＡ活性升高，Ｇｉα下降，缺氧条件下梭曼中毒与单纯梭曼中毒组有显著差别；阿托品可对抗ＰＫＡ活性的升高。在所观察的三个脑区中，以纹状体变化最为明显。结论Ｇ蛋白及其介导的ｃＡＭＰ－ＰＫＡ信号系统参与了缺氧条件下梭曼毒性升高的形成机制。

系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞G蛋白-cAMP信号机制的研究

目的 研究系统性红斑狼疮 (SLE)患者外周血淋巴细胞 (PBL)增殖反应与cAMP的关系以及G蛋白介导机制。方法 淋巴细胞增殖法 ,cAMP放免测定及G蛋白功能分析。结果 SLE患者PBL增殖反应增强与其cAMP水平的降低有关 ,百日咳毒素 (PT)可部分升高cAMP水平。结论 PT敏感的Gi蛋白

G蛋白偶联受体激酶2对EGF诱导的cAMP生成的调控

目的 研究G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)对表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)诱导cAMP生成的调控作用及其可能的机制。方法 用放射免疫竞争法测定EGF刺激前后细 胞内cAMP浓度。用免疫共沉淀的方法检测GRK2与EGF受体(EGF receptor,EGFR)的相互作用。结果 (1) EGF刺激使HEK293细胞内第二信使cAMP的浓度显著升高,约是Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的30％～ 40％。而过表达GRK2后,EGF刺激诱导的cAMP的浓度升高仅为Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的不足 10％(P<0．01),说明过表达GRK2能显著抑制EGF刺激的cAMP的生成。(2)免疫共沉淀实验的结果显示EGF 刺激后,EGFR受体免疫沉淀复合物中检测到大量GRK2,说明EGF刺激能诱导EGFR-GRK2复合物的形成。结论 GRK2对EGF刺激诱导的第二信使cAMP生成有负反馈调控作用,这种调控作用可能是通过EGF刺激的GRK2 与EGFR的相互作用来实现的。

川芎嗪调控Gαs/cAMP/PKA信号通路改善哮喘模型大鼠气道炎症的作用研究

目的探讨川芎嗪对卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏并攻击的幼龄哮喘大鼠Gαs/cAMP/PKA信号活性的影响。方法通过OVA致敏、攻击复制哮喘大鼠模型,观察川芎嗪干预后哮喘大鼠的气道高反应(airway hyperresponsiveness,AHR)、肺组织病理学变化,检测血清中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α的水平、血浆及肺组织中cAMP水平、肺组织PKA表达、肺组织Gαs、GRK2、CREB基因和蛋白表达。结果与对照组相比,哮喘大鼠肺阻力增加、肺顺应性降低(P<0.05),肺组织病理改变明显,外周血IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α水平明显升高(P<0.05);血浆及肺组织cAMP含量下降,肺组织PKA和CREB表达下调(P<0.01),肺组织中Gαs表达明显下调,而GRK2表达明显上调。与哮喘模型组相比,川芎嗪能够抑制AHR发生,降低哮喘大鼠的肺阻力(P<0.05),并增加肺顺应性,抑制大鼠肺组织炎症细胞浸润以及杯状细胞、纤维增生,明显降低哮喘大鼠外周血IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α水平(P<0.01);增加血清、肺组织cAMP含量及肺组织PKA、CREB的表达量,抑制大鼠肺组织中GRK2表达并上调Gαs表达(P<0.05)。结论川芎嗪能有效抑制哮喘大鼠AHR的发生,抑制炎症反应,这一作用可能与上调Gαs/cAMP/PKA通路活性相关。

左归丸对绝经后骨质疏松症大鼠骨组织中GPR48、CREB表达影响的实验研究

目的:通过研究去卵巢骨质疏松症大鼠股骨中GPR48和CREB的蛋白表达,探讨摘除卵巢致肾虚骨质疏松症的病理机制,并研究左归丸的作用机制。方法:摘除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,采用左归丸对实验大鼠治疗12周,以盖天力片作为阳性对照组,正常组、假手术组作为标准对照组,模型组作为空白对照,用ELISA法检测骨质疏松症大鼠股骨GPR48和CREB的蛋白表达。结果:ELISA方法检测表明:正常大鼠股骨中存在GPR48和CREB的蛋白表达。模型组大鼠股骨中GPR48和CREB的蛋白表达水平有明显的下降。左归丸组、盖天力组用药12周后,与模型组相比较,左归丸组可显著上调股骨中GPR48和CREB的蛋白表达水平。结论:1正常大鼠股骨中存在GPR48和CREB的蛋白表达;2股骨中GPR48和CREB的蛋白表达下降可能是导致骨质疏松症发生的机理之一;3左归丸能够上调GPR48和CREB的蛋白表达,表明左归丸对骨质疏松症有一定的防治作用。

cAMP反应元件萤光素酶报告基因载体的构建

目的:构建含有cAMP反应元件(CRE)的萤光素酶报告基因载体。方法:以含有gal4位点的萤光素酶报告基因质粒为模板,利用PCR方法,在去除gal4位点的同时,连入4个CRE元件得到pCRE-luc;将该载体与G蛋白偶联受体(GPCR)共转染人胚肾细胞HEK293,测定萤光素酶活性;应用蛋白激酶A(PKA)抑制剂确认CRE的活性是否与Gs通路相关。结果:pCRE-luc的活性直接相关于GPCR的激活程度,并依赖Gs信号通路。结论:CRE萤光素酶报告基因载体构建成功,可用于检测Gs偶联GPCR的活性,为基于GPCR的高通量药物筛选奠定了基础。

荧光共振能量转移法对细胞cAMP含量的实时检测

大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)转染pc DNA3-ICUE3质粒,用荧光共振能量转移(FRET)法观察前列腺素(PGE2)刺激下大鼠FLS环磷酸腺苷(c AMP)水平的实时变化,与放免法检测进行比较。FRET检测到FLS在PGE2刺激后1 min,c AMP升高14.93%,且不同批次实验差异较小;放免法检测到c AMP升高7.79%;FRET可检测到PGE2受体拮抗剂对c AMP产生的抑制,可观察到1 nmol/L PGE2促进c AMP产生,放免法检测PGE2产生效应最低浓度为0.1μmol/L。提示FRET法检测灵敏、重复性高,为G蛋白偶联受体信号通路研究的可靠技术手段。

G蛋白、AC、PDE和CREB SNPs与双相障碍的关联分析

目的:探讨G蛋白、腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)SNPs与双相障碍的关联分析。方法:①选择符合双相障碍诊断标准的患者84例(其中双相-Ⅰ型55例,双相-Ⅱ型29例),在同地区选择91名与之相匹配的健康人群,分别比较基因型、等位基因分布频率差异,同时探讨上述基因是否与双相障碍存在关联;②采用连接酶反应技术(LDR),检测GNβ3rs5443、ADCY9rs2230739 PDE1Ars1549870和CREB1rs2551638的4个单核苷酸的多态性。结果:病例组与对照组SNPs基因型频率和等位基因频率比较发现,rs5443、rs2230739、s1549870的基因型和等位基因比较差异均无显著性意义(P>0.05)。另外,不同亚型间SNPs基因型和等位基因分布比较:两组之间,rs5443、rs2230739和rs1549870的基因型分布频率和等位基因频率未见存在明显差异(P>0.05)。病例组双相-Ⅰ型与双相-Ⅱ型3个SNPs基因型和等位基因分布比较,也未见明显组间差异(P>0.05)。结论:①没有发现GNβ3rs5443、ADCY9rs2230739、PDE1Ars1549870这3个SNPs与双相障碍存在关联的直接证据;②CREB1rs2551638位点在汉族人群中不存在多态性。

解毒通络调肝方干预TGR5/cAMP信号通路靶向NLRP3炎症小体保护胰岛β细胞的作用机制

目的:探讨解毒通络调肝方通过胆汁酸G蛋白偶联受体5(TGR5)/环状磷酸腺苷(cAMP)信号通路靶向NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体保护胰岛β细胞的干预作用。方法:选用32只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、解毒通络调肝方低、高剂量组(3.6、7.2 g·kg^(-1))、二甲双胍组(0.2 g·kg^(-1)),8只db/m小鼠作为空白组,药物干预8周,每2周检测各组小鼠空腹血糖(FBG),并在末次给药后,进行口服糖耐量实验(OGTT),酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测空腹胰岛素(FINS)并计算β细胞功能稳态指数(HOMA-β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β水平。苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠胰腺组织病理学改变,免疫荧光测定小鼠胰腺组织胰岛素(Insulin)的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测TGR5/cAMP信号通路和NLRP3炎症小体关键靶点的蛋白、mRNA的表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠FBG、OGTT、FINS、IL-6、TNF-α和IL-1β显著升高(P<0.01);与模型组比较,药物治疗6周后,解毒通络调肝方组和二甲双胍组的FBG水平显著下降(P<0.01);OGTT实验结果表明,与模型组比较,各给药小组小鼠各时间点的血糖均有降低(P<0.05,P<0.01),解毒通络调肝方各剂量组和二甲双胍组FINS、TNF-α和IL-6水平明显降低(P<0.05,P<0.01),解毒通络调肝方高剂量组和二甲双胍组IL-1β水平显著降低(P<0.01)。胰腺病理显示模型组小鼠的胰岛形状不规则,分布不均匀,有萎缩的征象,解毒通络调肝方干预后,其细胞计数增加,边界更清晰;免疫荧光结果表示,空白组小鼠的胰岛细胞排列有序,形态饱满,伴有适当的胰岛素分泌,而模型组胰岛细胞形态扭曲,结构萎缩,胰岛素分泌变少,解毒通络调肝方各剂量组和二甲双胍组小鼠的胰岛素含量显著增加。与空白组比较,模型组小鼠胰腺组织中NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1) mRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,解毒通络调肝方高剂量组和二甲双胍组促进了TGR5和cAMP mRNA的上调,并下调了NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠TGR5蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,解毒通络调肝方高剂量组和二甲双胍组TGR5蛋白显著升高(P<0.01)。与空白组比较,模型组NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达显著增高(P<0.01);与模型组比较,解毒通络调肝方各剂量组、二甲双胍组Caspase-1、ASC蛋白表达显著降低(P<0.01),解毒通络调肝方高剂量组和二甲双胍组NLRP3蛋白表达显著降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠胰腺组织中cAMP含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,解毒通络调肝方高剂量组和二甲双胍组小鼠cAMP含量明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:解毒通络调肝方保护db/db小鼠的胰岛β细胞,其作用机制可能与调节TGR5/cAMP信号通路抑制NLRP3炎症小体有关。

抗抑郁药的信号转导机制

抗抑郁药的作用机制目前尚不明确 ,传统单胺递质理论和受体理论都不能充分解释抗抑郁药的临床效应滞后现象。近年提出抗抑郁药的信号转导机制 ,认为抗抑郁药是以G蛋白为分子基础 ,神经递质受体和G蛋白为作用环节 ,最终影响细胞内的信号转导并产生磷酸化作用增加、神经营养因子增多、神经发生增加等相关效应 ,从而发挥抗抑郁作用。影响细胞内信号转导并产生相关效应需要的时间 ,与抗抑郁药的临床效应滞后时间相吻合 ,从而使抗抑郁药的滞后现象有了合理解释。这个机制的提出有助于抗抑郁新药的发展 ,为研制安全、有效的新药指明了方向 ,同时也为抑郁症生物学病因的阐明提供了必要信息。

霍乱毒素对不同细胞株增殖效应的影响

以霍乱毒素(CTX)为探针,以不同细胞株体外增殖和细胞内cAMP水平为观察指标,探讨霍乱毒素对不同细胞株体外增殖的影响。结果表明,CTX对淋巴细胞的增殖抑制作用随细胞不同而异,CTX(1mg/L)可显著升高Daudi、K562细胞内cAMP水平(均为P<0.05),并对上述细胞的增殖具有显著抑制作用(均为P<0.05);对CTLL细胞cAMP水平影响,但可显著抑制CTLL细胞的增殖(P<0.01);而对HL-60细胞的增殖和细胞内cAMP水平均无明显影响。

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。

基于GPR119/cAMP/GLP-1通路探讨葛根芩连汤的降糖机制

目的:探讨葛根芩连汤(GGQL)对肠道上皮细胞增殖和凋亡的影响,并通过其对细胞环磷酸腺苷(cAMP),G蛋白偶联受体119(GPR119)表达的影响探讨其对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的影响和潜在降糖机制。方法:对25只Wistar大鼠按生药23 g·kg^(-1),每天2次予以葛根芩连汤灌胃,每只大鼠每天灌胃6 mL,以制备含葛根芩连汤的血清,连续给药7次。用不同浓度葛根芩连汤含药血清(1%,2.5%,5%,7.5%,10%)培养肠道上皮L细胞系NCI-H716细胞;细胞增殖与活性检测(CCK-8)评估细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中GLP-1,cAMP含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测GLP-1,GPR119 mRNA水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GLP-1,GPR119蛋白表达水平。结果:与空白组比较,葛根芩连汤明显减少了NCI-H716细胞的增殖(P<0.05),且随着葛根芩连汤浓度的增加,其抑制作用更加明显;每种浓度的葛根芩连汤均明显促进NCI-H716细胞凋亡(P<0.05),并且与空白组比较,葛根芩连汤明显提高cAMP,GLP-1,GPR119的表达(P<0.05)。葛根芩连汤的作用与其浓度呈正相关,其中10%葛根芩连汤表现出最好的作用。结论:葛根芩连汤可有效抑制NCI-H716的增殖并促进其凋亡,其可能通过上调cAMP,GPR119的表达而促进GLP-1的分泌。

霍乱毒素对淋巴细胞活化增殖的影响及其机制

研究探讨霍乱毒素（ＣＴＸ）对淋巴细胞活化、增殖的影响及可能的作用机制。研究结果表明， ＣＴＸ可显著升高静息ＰＢＭＣ和／或ＣＤ３单抗激活的琳巴细胞内ｃＡＭＰ水平，该效应与ＣＴＸ抑制淋巴细胞增殖和ＩＬ－２的作用密切相关； ＡＣ激活剂Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ通过升高细胞内ｃＡＭｐ水平，对于ＣＤ３单抗激活的淋巴细胞增殖有明显的抑制作用；ＣＴＸ不能干扰ＩＬ－２依赖株ＣＴＬＬ细胞的增殖效应，也不影响ＣＴＬＬ细胞内ｃＡＭＰ水平。实验结果提示，ＣＴＸ敏感的Ｇ蛋白亚类参与了ＣＤ３单抗对淋巴细胞活化的调节，ＣＴＸ的抑制作用与其升高细胞内ｃＡＭｐ水平有关。