褐飞虱G蛋白β亚基基因的功能分析

【目的】本研究旨在鉴定褐飞虱Nilaparvata lugens G蛋白β亚基基因(NlGβ)并分析其功能,以期为基于RNAi技术防治褐飞虱提供潜在的新靶标基因。【方法】利用PCR克隆并验证褐飞虱NlGβ的编码序列(coding sequence,CDS)并进行生物信息学分析;基于褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和成虫不同组织(头、足、肠道、表皮、脂肪体、雌性生殖系统和雄性生殖系统)转录组表达谱分析NlGβ的时空表达模式;通过对2和5龄褐飞虱若虫进行显微注射dsRNA沉默NlGβ,观测个体和雌性生殖系统表型,统计存活率、单雌产卵量和卵孵化率,利用透射电子显微镜技术观察侧输卵管膨大区。【结果】褐飞虱NlGβ(GenBank登录号:XP_022200908.1)的CDS长948 bp,NlGβ蛋白包含7个WD40结构域和4个WD_REPEATS_1基序,是一个较为保守的蛋白,除了直翅目昆虫外,来源于其他昆虫目中的NlGβ同源蛋白能很好地聚集在同一簇进化分支上。NlGβ的表达量在1-3龄若虫期呈现周期性变化,在5龄雌若虫和雌成虫中的表达量高于5龄雄若虫和雄成虫中的;NlGβ在成虫不同组织中都表达,但在脂肪体中表达量最高,在雌性生殖系统中的表达量高于雄性生殖系统中的。沉默褐飞虱2龄若虫NlGβ,出现蜕皮困难的现象,导致存活率较ds GFP对照组显著降低;沉默褐飞虱5龄若虫NlGβ,雌成虫腹部异常膨大,卵巢发育畸形,单雌产卵量较对照组显著下降,卵无法孵化,侧输卵管膨大区内分泌物增加,上皮细胞发生降解。【结论】NlGβ与褐飞虱的生长发育和雌虫的繁殖密切相关。

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。

水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列(AY884129)设计引物,对水稻立枯丝核菌AG-1IA的G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9kb的扩增片段,包含1个约1.7kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量G蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%～88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT-PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG-1IAG蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。

大豆立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆与分析

由立枯丝核菌[Rhizoctonia solani Khn,有性世代:Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk]引起的大豆纹枯病(soybean sharp eyespot)是一种重要病害。G蛋白β亚基(guanine nucleotide binding protein beta-subunit)作为重要的信号传导因子,在植物病原菌致病分子机制中起着重要作用。为了解G蛋白β亚基基因的结构与功能,根据同源物种G蛋白β亚基相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术克隆了大豆立枯丝核菌G蛋白β亚基的基因序列和开放阅读框(G-protein beta-subunit of soybean Rhizoctonia solani,简写为gbsrs1,GenBank登录号为EU663628)。该片段全长1864bp,含有4个内含子和5个外显子;开放阅读框(ORF)长1047bp,编码348氨基酸残基,与多种真菌G蛋白β亚基的氨基酸序列相似程度较高,达79.72%～99.43%;该蛋白质具有2个α-螺旋和7个β-折叠的二级结构,形成无规则卷曲连接的桶形三级结构。将gbsrs1的ORF连接于原核融合表达载体pGEX-4T-2中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。gbsrs1的克隆和特性研究为了解大豆立枯丝核菌的致病机理、有效防治纹枯病奠定了基础。

小麦与叶锈菌互作体系中G蛋白α、β亚基的表达及其与抗病蛋白和活性氧代谢的关系

为了从基因表达水平和抗病生理水平上了解小麦与叶锈菌互作过程中G蛋白的α、β亚基的作用,进一步揭示小麦的抗叶锈病分子机制和信号转导途径,以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr1和叶锈菌05-22-64/05-8-63①为材料,构建了小麦与叶锈菌互作的亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦G蛋白α、β亚基的基因表达量进行了检测。另外,以清水为对照,检测亲和与非亲和互作组合中,以及G蛋白抑制剂百日咳毒素PTX处理后再接种无毒性菌株的处理中,几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶以及活性氧产生速率的变化。结果发现,G蛋白的α亚基和β亚基都参与了小麦抗叶锈病的反应,并且可能在信号传递过程中起重要作用。无毒性叶锈菌可诱导G蛋白基因表达量的升高,而毒性叶锈菌会抑制G蛋白基因的表达。G蛋白α、β亚基在抗病反应信号传递过程中先后次序不同,β亚基基因的表达先于α亚基基因且表达量高于α亚基基因。另外,G蛋白可能通过诱导防卫酶和活性氧产生的增加来提高小麦对叶锈病的抗性。

粟弯孢霉叶斑病菌G蛋白β亚基基因克隆及表达

旨在获得粟弯孢霉叶斑病菌G蛋白β亚基基因,明确其表达模式,为阐明该基因对粟弯孢霉叶斑病菌致病性的调控机制奠定基础。运用SMART RACE RT-PCR技术,克隆粟弯孢霉叶斑病菌G蛋白β亚基基因ClGβ全长cDNA序列,以qRT-PCR技术,对该基因在粟弯孢霉叶斑病菌不同生长时间的表达特征进行分析。结果表明,ClGβ基因cDNA编码区为1 056 bp,DNA包含4个内含子和5个外显子,编码351个氨基酸。该基因的cDNA序列在GenBank中注册的登录号为JQ768316。qRT-PCR结果表明,Gβ基因在菌株生长过程中表现出前期表达量较低而后期表达量明显升高的趋势。构建了pET28(a)-ClGβ原核表达载体,经IPTG诱导,目的蛋白在宿主菌E.coli BL21中获得表达,表达产物分子量与ClGβ蛋白计算分子量一致。

抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因

灵芝细胞在液体静置和振荡培养方式下,抗癌物质灵芝酸的产量有显著的差别。采用抑制消减杂交法分离了灵芝细胞在两种不同培养方式下差异表达的基因,对构建的差减文库进行筛选后获得了一个灵芝的EST序列。根据这个EST序列,采用RACE-PCR的方法成功克隆到了灵芝G蛋白β亚基(Gb)基因(GenBank登录号GQ293361)。序列分析显示这个基因cDNA全长1217bp,编码了313个氨基酸。同源性分析表明其编码的氨基酸与其他蘑菇类真菌Gβ的氨基酸序列同源性较高,与Coprinopsis cinerea(XP_001830441.1)、Lentinula edodes(AAP13580.2)和Schizophyllum commune(XP_003029882.1)的一致性分别达到91%、91%和90%。实时荧光定量PCR结果表明这个基因在液体静置培养方式下的表达量显著高于振荡培养。

大豆(Glycine max)GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆（Glycinemax）中克隆了一个与抗逆相关的DREB（Dehydration Responsive Element Binding Protein）基因GmDREB5。功能分析证明,GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白,采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库,发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域,与棉花（Gossypium hirsutum）和水稻（Oryza sativa）的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性,说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基,将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109,转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上（SD/trp^-leu^-his^-ade^-）正常生长,而对照不能生长;同时,共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达,证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明,GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达,证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应,同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。

免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白

为了进一步阐明G蛋白β亚基2样1蛋白(guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP)在普萘洛尔(propranolol,PRO)生物学效应发生机制中的作用,采用免疫共沉淀法结合液相色谱-芯片-离子阱串联质谱(HPLC-CHIP-IT-MS/MS)系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中的GBLP相互作用蛋白.结果表明,有7种蛋白与GBLP存在相互作用,分别为酪蛋白α-S1、酪蛋白α-S2、β酪蛋白、桥粒芯蛋白1前体、α-烯醇化酶、果糖二磷酸醛缩酶C、硫氧还原蛋白过氧化物酶2.这些蛋白的生物信息学检索结果提示,GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关.

应用酵母双杂交研究G蛋白通路中的蛋白因子

目的 探寻 G蛋白信号传导途径中与 G_β亚基相互作用的下游蛋白因子，揭示 G蛋白信号传导通路的机制。 方法 采用敏感性较高的酵母双杂交体系，构建含 G_β亚基基因的饵质粒筛选人脑 cDNA文库。结果 获得了肌动蛋白集束调控蛋白 (actin bundling protein)的编码基因和两个新基因片段， GeneBank登录号分别为 AF288405（ 427 bp）及 AF288406（ 2 832 bp）。结论 提示在人脑组织中 G_β亚基作为结构和功能单位可能通过与 actin bundling protein及另两种未知的蛋白因子间的相互作用而介导了信号的传导，对于揭示 G蛋白信号传递通路与 actin细胞骨架之间的关系起重要的提示作用。

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.

辣椒CaArcA基因的电子克隆与生物信息学分析

目的:获得辣椒(Capsicum annuum)G蛋白β亚基基因(CaArcA)序列。方法:以拟南芥同源序列为探针,利用电子克隆技术获得了CaArcA基因的cDNA全长,采用生物信息学方法,对该基因所编码的蛋白从理化性质、分子进化、高级结构等多角度进行分析。结果:该基因cDNA全长1 173 bp,其开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸,分子量为36.1 kDa;具有23个磷酸化位点,无信号肽和跨膜区域,定位在细胞膜外。通过同源比对发现,CaArcA蛋白与与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的同源蛋白相似性在80%以上。结论:利用电子克隆的方法获得一个辣椒G蛋白β亚基基因的cDNA序列。