多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立

目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。

大连市首次在急性胃肠炎暴发疫情标本中检出GⅠ型诺如病毒

目的为确定引起大连市某幼儿园急性胃肠炎暴发疫情的病原体,对患儿粪便和呕吐物标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT-PCR法对12份标本进行GⅠ型和GⅡ型诺如病毒RNA检测。结果 12份患儿标本中,9份GⅠ型诺如病毒核酸阳性。结论首次在大连地区发现由GⅠ型诺如病毒引起的暴发疫情。

2017-2018年浙江省湖州市急性胃肠炎病例GⅠ型诺如病毒感染状况及其基因型别特征

目的了解浙江省湖州市急性胃肠炎病例中GⅠ型诺如病毒的感染状况及基因型别特征。方法收集2017年4月至2018年6月湖州市2家哨点医院诊断为急性胃肠炎病例的粪便标本1 259份。采用实时荧光定量反转录–聚合酶链式反应(real time RT-PCR)对提取的病毒RNA进行GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸检测。采用RT-PCR对GⅠ型阳性标本进行RdRp区和VP1区部分片段的扩增和测序。综合在线分型工具和系统进化分析的结果判定病毒基因型别。结果诺如病毒核酸阳性171份,阳性率13.58%。GⅡ型和GⅠ型诺如病毒的检出阳性率分别为11.83%(149/1 259)和2.70%(34/1 259),GⅡ型诺如病毒为检出的主要型别。GⅠ型诺如病毒主要检出于2018年上半年。2018年2-6月各月GⅠ型诺如病毒的检出阳性率均大于监测期间GⅠ型的平均检出阳性率。基因分型结果显示,2018年检出的GⅠ型诺如病毒包括GⅠ.P4-GⅠ.5、GⅠ.P2-GⅠ.2、GⅠ.P1-GⅠ.1、GⅠ.Pd-GⅠ.3、GⅠ.P4-GⅠ.4、GⅠ.P2-GⅠ.5。其中GⅠ.P4-GⅠ.5、GⅠ.P2-GⅠ.5和GⅠ.Pd-GⅠ.3重组型诺如病毒首次在湖州市检出。结论湖州市流行的GⅠ型诺如病毒基因型别多样,重组现象明显。应加强GⅠ型诺如病毒在当地的分子流行病学监测,以及时发现新的变异或重组株。

单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型

目的建立能同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法。方法分别选用轮状病毒NSP3基因、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型orf1与orf2基因中的64 bp、90 bp和185 bp片段作为荧光定量PCR检测的靶标,设计引物和Taq Man探针,构建标准品,绘制标准曲线,评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度,并对138份粪便标本进行检测及测序验证。结果 3种病毒对应的标准曲线分别为:轮状病毒:y=-3.9lgx+41.204;诺如病毒GⅠ型:y=-3.06lgx+40.716;诺如病毒GⅡ型:y=-3.29lgx+41.538,质粒标准曲线的方差系数为0.997,灵敏度达到每个反应102copy/μl,特异度强。138份样本中检出A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的检出率分别为32.6%、5.8%和26.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建可用于A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。

贝类GⅠ型扎幌样病毒荧光定量PCR检测

目的建立贝类中GⅠ型扎幌样病毒的荧光定量PCR检测方法。方法通过用聚乙二醇6000（PEG6000）对贝类中扎幌样病毒进行浓缩,用序列比对软件设计出针对GⅠ型扎幌样病毒保守序列的通用引物与探针,建立GⅠ型扎幌样病毒荧光定量PCR检测方法。结果浓度为10^6-10^4,10^3,10^2-10^1拷贝/μL的GⅠ扎幌样病毒检出率分别为3/3,1/3,0/3,因此,常规逆转聚合酶链反应（RT-PCR）最低检出限为10^3拷贝/μL。此荧光定量PCR方法对贝类中GⅠ型扎幌样病毒检测高度特异,最低检出限可达10^2拷贝/μL,比常规RT-PCR的低1个数量级,即灵敏度高10倍,线性范围为10^2-10^6拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.998 8。结论本研究建立了GⅠ型扎幌样病毒的荧光定量PCR检测方法,可用于贝类中GⅠ型扎幌样病毒污染状况及其突发事件的快速定量检测。

GⅠ-Ⅱ型粉浆涂塑铝瓷底层冠专用代型材料对铝瓷底层冠适合性影响的初步研究

目的 :了解GⅠ Ⅱ型铝瓷专用代型材料对铝瓷底层冠适合性的影响。方法 :采用片切后SMI体式显微镜观察测量的方法测量在专用代型材料上制作的GⅠ Ⅱ型铝瓷底层冠粘固后的边缘浮出量及粘固剂厚度值。结果 :粘固后铝瓷底层冠边缘浮出量为 44 .2 1μm ,整体粘固剂厚度为 42 .2 5 μm。 结论 :GⅠ Ⅱ型专用代型材料的凝固膨胀较好地补偿了铝瓷的烧结收缩 ,制作的铝瓷底层冠具有良好的边缘适合性。

GI-II型渗透陶瓷热膨胀性能分析

目的:本实验旨在研究GⅠ-Ⅱ型渗透陶瓷的热膨胀特性.材料与方法:制作GI-II型渗透陶瓷氧化铝预制体,GⅠ-Ⅱ型渗透陶瓷In-Ceram待测试件,测试其热膨胀曲线.结果:50-600 ℃的热膨胀系数(×10^(-6)/℃)分别是7.65(氧化铝预制体)、7.25(GⅠ-Ⅱ型渗透陶瓷)、7.858(In—Ceram).100—300℃热膨胀系数(×10^(-6)/℃)分别是7.365(氧化铝预制体)、6.412(渗透玻璃)、7.024(GⅠ-Ⅱ型渗透陶瓷)、7.365(In-Ceram).结论:GⅠ-Ⅱ型氧化铝预制体与渗透玻璃的热膨胀差异不影响渗透陶瓷的力学性能.其渗透陶瓷与饰面资热膨胀匹配.

模压成型工艺参数对CF/PEEK复合材料Ⅰ型层间断裂韧性的影响

连续碳纤维增强聚醚醚酮(CF/PEEK)复合材料是重要的医疗器械及航空航天热塑性复合材料,可采用模压成型工艺制备层合板及结构,其工艺参数影响复合材料力学性能。本文主要考察了模压成型温度、压力以及降温速率等参数对CF/PEEK复合材料Ⅰ型层间断裂韧性(G IC)的影响规律,并通过扫描电镜表征复合材料撕裂面的微观形貌,分析材料失效模式。较高的模压成型温度可提高基体分子链流动性,适中的成型压力有利于控制树脂不被过多挤出模具,适中的降温速率可降低结晶度并抑制界面粘结强度的损失,均有利于提高CF/PEEK复合材料的G IC。

GⅠ.1型人札如病毒的体外培养及其衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的体外培养GⅠ.1型人札如病毒(human sapovirus,HuSaV),并制备其衣壳蛋白VP1多克隆抗体。方法将中国疾病预防中心病毒病预防控制所腹泻室保存的GⅠ.1型HuSaV阳性粪便标本接种至添加不同胆酸盐[甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨胆酸(GCA)]的人十二指肠腺癌细胞(HuTu-80)中,利用PCR和RT-qPCR法确定病毒感染、增殖及传代情况。PCR扩增VP1基因,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-VP1,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组VP1蛋白纯化后免疫2只雌性新西兰大耳白兔,共免疫4次,免疫后18、28、38和48 d采血,ELISA法检测血清效价。结果GⅠ.1型HuSaV在胆酸盐GCA存在下可有效感染HuTu-80细胞,增殖后的病毒在HuTu-80细胞中能够稳定连续传3代。表达的重组GST-VP1蛋白相对分子质量约86000,纯化后约60000(切除GST标签)。制备的抗HuSaV VP1蛋白多克隆抗体效价可达1∶12800以上。结论利用HuTu-80细胞添加胆酸盐成功实现了HuSaV的体外分离培养,并制备了HuSaV VP1蛋白高效价多克隆抗体,为深入开展HuSaV的鉴定、感染及致病机制等奠定了基础。

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

南宁市散发性急性胃肠炎病例中检出GⅠ.8型诺如病毒

目的研究南宁市某医院散发性急性胃肠炎病例中,GⅠ.8型诺如病毒(Norovirus,NV)的基因特征。方法采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应,对2007年1月～2008年12月南宁市某医院散发性急性胃肠炎病例标本检测基因Ⅰ型(GenogroupⅠ,GⅠ)NV核糖核酸,对阳性标本进行N/S区核苷酸序列测定,并构建系统进化树分析。结果在696份粪便标本中,检出3份GⅠ型NV核酸阳性。经核酸序列分析发现,其中一份[南宁(Nanning,NN)07230]与GⅠ.8型参考株(WUGⅠ/00/JP)的核苷酸序列同源性达94.5%;与2006～2007年日本、韩国公布的GⅠ.8型NV核苷酸序列同源性范围在96.7%～98.5%。NN07230在进化树中与GⅠ.8型病毒株属同一分支。结论在南宁市散发性急性胃肠炎病例中存在GⅠ.8型NV感染。

常规RT-PCR快速检测诺如病毒方法的建立

目的建立一种可同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒(Norovirus,NOV)的常规RT-PCR方法.方法针对GⅠ、GⅡ型诺如病毒RdRp区域的基因进行引物设计,优化PCR反应体系及条件,评价该方法的灵敏度、特异度.结果该引物对诺如病毒的特异度强,同一体系内的GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间无干扰,与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时检测无交叉反应;对GⅠ、GⅡ型诺如病毒核酸的最低检测限值是10~3拷贝/μL.结论本研究建立常规RT-PCR检测方法对GⅠ、GⅡ型诺如病毒进行快速检测,具有很好的灵敏度和特异性.

Allglo探针与Taqman探针双重荧光RT-PCR法检测GI型和GII型诺如病毒的比较和应用

目的对Allglo探针和Taqman探针检测GI型和GII型诺如病毒的双重荧光RT-PCR方法进行比较,并应用于临床标本的检测。方法设计针对GI型和GII型诺如病毒的Allglo探针和Taqman探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对这两种方法的特异性、灵敏度进行比较评估,对56份临床粪便标本进行检测,并统计结果。结果这两种方法特异性强;最低检测限均为102copies/μL以下;但是Allglo探针在同一浓度下比Taqman探针CT值更低,扩增效率更高。对56份临床粪便标本进行检测,两种方法结果一致。结论 Allglo探针双重荧光RT-PCR方法较之Taqman探针检测GI型和GII型诺如病毒扩增效率更高,两者均可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查。

GI-Ⅱ型渗透陶瓷与Vitadur α饰面瓷结合界面的研究

目的 多层构筑法制作修复体时 ,层间的结合与匹配性是修复体成功的关键。本项研究的目的在于考察GI Ⅱ型渗透陶瓷底层与Vitadurα饰面瓷之间的界面结合及匹配性 ,为其临床应用奠定基础。方法 制作 2 5mm× 5mm× 1mm的渗透陶瓷样本一个 ,底部预制刻痕 ,在上表面依次烧结 0 2mm的Vitadurα不透明牙本质瓷和 0 6mm的牙本质瓷 ,从刻痕处折断 ,断面作扫描电镜 (SEM)观察和电子探针界面分析 (EMPA)。另制作以GI Ⅱ型渗透陶瓷材料为底层 ,Vitadurα为饰面瓷的上中切牙全瓷单冠 10个 ,作热冲击实验。结果 SEM结果显示 ,GI Ⅱ型渗透陶瓷底层和Vitadurα饰面瓷之间相互融合 ,结合紧密。界面EMPA分析结果显示 ,底层瓷和饰面瓷之间有元素的相互渗透现象 ,Na、Al元素越过界面向饰面瓷中渗透 ,Si、K、Ca元素则由饰面瓷向底层瓷中渗透。全冠样本的热休克温度为 (15 8± 10 3)℃ ,裂纹多出现于饰面瓷瓷层厚度较大的部位。结论 GI Ⅱ型渗透陶瓷底层材料和Vitadurα饰面瓷之间具有良好的结合性及热匹配性。

2013年海盐县诺如病毒流行株的监测和基因型分析

目的了解2013年海盐县诺如病毒流行株基因型谱分布。方法 2013年收集170例腹泻患者粪便标本,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测诺如病毒核酸,挑选部分毒株进行核苷酸序列测定并构建系统进化树。结果检测170例腹泻患者粪便标本,诺如病毒阳性24份,检出率为14.12%;其中诺如病毒GⅠ基因组1份,占4.17%,序列测定为GⅠ.2基因型;GⅡ基因组23份,占95.83%,选4株进行序列测定,比对结果 1株属于GⅡ.4基因型2006b变异株,3株属于GⅡ.4基因型Sydney变异株。结论 2013年海盐县诺如病毒流行株基因型呈现多样性,以GⅡ.4 Sydney变异株为优势流行株,首次检出GⅠ基因组。

云南省某中学一起诺如病毒暴发疫情的病原鉴定和基因特征分析

目的明确2022年云南省某中学一起急性肠胃炎暴发疫情的病原和基因特征。方法采集这起暴发疫情中的学生和厨工病例的肛拭子,使用诺如病毒GⅠ/GⅡ双通道核酸检测试剂盒定性检测。GⅠ和GⅡ阳性的样本分别采用引物G1SKF/G1SKR和MON431/G2SKR进行病毒扩增和测序,通过在线分型工具及系统进化分析确定病毒基因型别。结果共采集58份肛拭子,实验室检测阳性率为53.45%(31/58)。其中,GⅠ阳性样本22份,GⅡ阳性样本14份,GⅠ和GⅡ合并感染样本5份。31份阳性样本基因测序获得毒株序列22株,包括诺如病毒GⅠ型15株,其中GⅠ.6[P6]型9株、GⅠ6.[P11]型6株;诺如病毒GⅡ.4[P16]型7株。结论本起疫情由诺如病毒GⅠ.6[P6]型、GⅠ.6[P11]型和GⅡ.4[P16]型混合感染引起,这是云南省首次在诺如病毒暴发疫情中检出GⅠ型。

2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染状况

目的了解2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒的感染情况,及时掌握诺如病毒的流行趋势,提高防控能力。方法对2015年大连市10家哨点医院采集的1 247份标本进行诺如病毒荧光定量RT-PCR检测。结果诺如病毒核酸检测总阳性率为1.92%,其中GⅡ型阳性率1.60%,GⅠ型阳性率0.32%。结论大连市首次在急性胃肠炎病例中监测到GⅠ型诺如病毒,2015年大连市急性胃肠炎病例中诺如病毒感染以GⅡ型为主。