双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

钦州市售贝类GⅡ型诺如病毒污染调查

文章对钦州市售的16种贝类进行GⅡ型诺如病毒污染调查,在采集的342份贝类样品中,共检出阳性样品55份,平均检出率为16.08%。其中牡蛎的阳性率最高,检出率为33.33%;在阳性样品中,病毒平均感染强度为1.66×10^(5)copies/g(消化腺),病毒含量主要集中在104~10^(5)copies/g数量级之间,占比为45.45%。研究显示钦州市售贝类中存在较高的诺如病毒污染水平,需要加强对市售贝类诺如病毒污染的持续监测与风险评估,保障消费者的食品安全。

多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立

目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。

诺如病毒GⅡ型流行病学研究进展

诺如病毒是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要病原体之一,给全球的社会医疗和公众健康带来了严重负担。监测显示,全球75%~100%的诺如病毒病例都是由GⅡ型引起。诺如病毒GⅡ型急性肠胃炎已成为公共卫生领域的热点问题。本文对诺如病毒GⅡ型病原学、流行概况及流行病学特征等方面研究进行综述。

西生菜中低污染量GⅡ型诺如病毒的富集与定量检测研究

目的优化新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR与微滴式数字RT-PCR检测方法,研究适用于新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒的定量检测方法。方法选取洗脱液种类、沉淀剂种类、沉淀剂作用温度及沉淀剂作用时间4个因素进行研究,以确定较优的GⅡ型诺如病毒富集条件。结合较优的富集条件,分别采用实时荧光RT-PCR方法和微滴式数字RT-PCR方法进行定量检测。结果病毒富集方法研究表明:洗脱液为牛肉膏-甘氨酸洗脱液、沉淀剂为PEG6000+PEG8000、沉淀剂作用温度为4℃,沉淀剂作用时间为4 h为较优条件,此时富集后的平均病毒浓度最高,平均回收率可达53.43%。实时荧光RT-PCR的检测限为1.44×10~4 copies/g;而微滴式数字RT-PCR的检测限为7.86×10~2 copies/g。结论通过优化西生菜中低污染量的GⅡ诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR方法与微滴式数字RT-PCR方法定量检测病毒的效果,建立了适用于西生菜样品中低污染量GⅡ诺如病毒的定量检测方法。

一起诺如病毒GⅡ型引起的学校感染性腹泻聚集性疫情流行病学

2017年12月,湖北省天门市某小学发生一起其它感染性腹泻疫情.12月4日至12月10日,该校共有10名学生发病,罹患率0.78%.病原学检测结果为诺如病毒 GⅡ型.

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。

25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻和传统麻醉方法在宫腔镜手术中的应用对比

目的对比25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻和传统麻醉方法在宫腔镜手术中的应用效果。方法随机选取2016年2月至2018年2月本院收治的行择期宫腔镜手术患者60例,依据麻醉方法将这些患者分为25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻组(n=30)和传统麻醉方法组(n=30)两组,对两组患者不同时间点的心率(HR)、平均动脉压(MAP)、呼吸频率(RR)、动脉血氧饱和度(SpO2)变化情况、不良反应发生情况及宫颈松弛情况进行统计分析。结果 25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻组患者T2时的HR显著低于T0时(P<0.05),传统麻醉方法组患者T1时的HR、MAP、SpO2均显著低于T0时(P<0.05);T1时25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻组患者的HR显著高于传统麻醉方法组(P<0.05),T2时显著低于传统麻醉方法组(P<0.05),T1时SpO2显著高于传统麻醉方法组(P<0.05),不良反应发生率3.3%(1/30)显著低于传统麻醉方法组86.7%(26/30)(P<0.05),宫颈松弛率73.3%(22/30)显著高于传统麻醉方法组3.3%(1/30)(P<0.05)。结论 25GⅡ型腰椎穿刺针腰麻较传统麻醉方法在宫腔镜手术中的应用效果好。

FANUC系统指令G71Ⅱ型在数控教学实践中的巧用

在葫芦的数控加工中,由于葫芦外轮廓的凸凹变化,使用G71粗车复合循环加工指令具有局限性;而实践教学中的毛坯多为棒料,使用G73指令又会产生过多的空走刀现象,基于这两者之间的矛盾,将教材中很少提到的G71Ⅱ型循环加工指令应用于实际教学实践中,既能解决零件外轮廓加工时凸凹变化的问题,又能简化程序运算强度,提高加工效率。

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。

环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究

自行设计一种适合野外现场采样的病毒采集浓缩仪,采用一种新型阳离子膜NanoCeram,进行环境水体中GⅡ型诺如病毒浓缩研究。通过预实验,考察了预处理膜、不同的二次浓缩方法、不同洗脱液对病毒回收率的影响,随后优化整个浓缩过程并确定最佳的病毒浓缩方法。结果显示,预处理膜对病毒回收影响较大,PEG-NaCl沉淀、硅藻土吸附这两种二次浓缩方法的效果相当,选择0.15mol/L Na2HPO4作为硅藻土洗脱液。确定了NanoCeram阳离子膜的病毒回收率为3.02%。最后对北京市丰台区洋桥生活污水进行现场采样,成功检测到GⅡ型诺如病毒,证明该方法有效可行,适合于环境水体中诺如病毒的浓缩分离和检测。

2015—2016年上海地区成人门诊腹泻病例中诺如病毒GⅡ型流行特征

目的了解2015—2016年上海地区成人门诊急性腹泻病例中诺如病毒(norovirus,NoV)GⅡ型的基因分型及分子流行病学特征。方法收集上海地区2015年3月至2016年12月912份成人急性腹泻粪便标本,采用一步法定量逆转录PCR方法检测NoV GⅡ型,并扩增开放阅读框1(open reading frame,ORF1)的聚合酶和ORF2衣壳区域进行测序分型。结果2015年3月至2016年12月912份成人急性腹泻粪便标本NoV GⅡ型阳性检出率为17.76%(162/912),其中2015年NoV GⅡ型阳性率为15.08%(65/431),2016年阳性率为20.17%(97/481),阳性标本中针对ORF1的RdRp区域和ORF2区域5′端均分型的标本为145份,共有10种型别,分别为GⅡ.Pe_GⅡ.4 Sydney 2012(60份)、GⅡ.P17_GⅡ.17(45份)、GⅡ.P16_GⅡ.13(10份)、GⅡ.P12_GⅡ.3(10份)、GⅡ.P7_GⅡ.6(9份)、GⅡ.P21_GⅡ.21(5份)、GⅡ.P16_GⅡ.4 Sydney 2012(2份)、GⅡ.Pe_GⅡ.17(2份)、GⅡ.P2_GⅡ.2(1份)、GⅡ.P7_GⅡ.14(1份)。结论上海地区2015年春季主要流行GⅡ.P17_GⅡ.17,2015/2016年冬春季主要流行GⅡ.Pe_GⅡ.4 Sydney 2012和GⅡ.P17_GⅡ.17,而2016年秋季主要以GⅡ.Pe_GⅡ.4 Sydney 2012流行为主。进行持续的NoV暴发监测对于确定基因型分布的变化趋势和新毒株的发现非常重要。

检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较

目的建立鲜草莓中GⅡ型诺如病毒(No V GⅡ)的实时荧光RT-PCR检测方法,评价磁珠富集法和PEG(聚乙二醇)沉淀法对检测草莓中No V GⅡ的适用性,对北京地区采集的18份草莓样品进行检测。方法参照ISO/TS 15216-1《实时荧光RT-PCR方法测定食品中甲型肝炎病毒和诺如病毒水平方法》合成检测No V GⅡ的特异性引物和探针,分别采用磁珠富集法和PEG沉淀法富集病毒,然后提取RNA,建立实时荧光RT-PCR检测方法,并对提取条件进行优化。结果磁珠富集法的最高回收率为1.730%(PBS缓冲液),PEG沉淀法的最高回收率为1.682%(TGBE缓冲液),18份草莓样品均未检出No V GⅡ。结论通过磁珠富集法和PEG沉淀法建立的病毒检测的富集方法均适用于鲜草莓中No V GⅡ的检测。

牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速检测方法研究

目的建立牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速有效的检测方法,为食源性疾患疫情暴发的溯源提供可靠的实验室依据。方法梯度稀释含有GⅡ型诺如病毒的便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中,用蛋白酶K消化-PEG6000沉淀方法富集后,实时荧光RT-PCR进行终端检测,评估灵敏度及回收率。结果该方法的灵敏度为3.91×103copies/g,病毒平均回收率为6.64%。结论蛋白酶K消化-PEG沉淀法操作简单、快速,有望进一步优化后应用于不同贝类中病毒的检测。

GⅡ型诺如病毒装甲RNA质控品研制

目的采用MS2噬菌体装甲RNA技术构建内含GⅡ型诺如病毒RNA的装甲RNA质控品,为诺如病毒核酸检测提供安全稳定的标准品。方法将MS2噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白和调节位点基因(PAC基因)及GⅡ型诺如病毒520 bp片段克隆到表达质粒pET30b中,构建重组质粒p ET-PAC,pET-PAC转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞进行原核表达,表达产物纯化后鉴定并进行定量及稳定性分析。结果研究成功构建和表达了耐RNA酶、内含GⅡ型诺如病毒片段的装甲RNA——AR-GⅡ。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示AR-GⅡ病毒颗粒的蛋白分子量约为14.4 kD,纯化后的AR-GⅡ无宿主菌DNA、RNA等杂质残留,每1 m L LB培养基可诱导约1.5×10^(12)copies的AR-GⅡ。AR-GⅡ在37℃、4℃条件下可以稳定8周以上,-20℃反复冻融8次RNA病毒浓度也无明显衰减,稳定性良好。结论基于MS2噬菌体制备的AR-GⅡ拷贝数高,稳定性好且能耐受RNA酶攻击,可以作为标准样品用于监控诺如病毒核酸提取、反转录和扩增等全过程。

单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型

目的建立能同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法。方法分别选用轮状病毒NSP3基因、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型orf1与orf2基因中的64 bp、90 bp和185 bp片段作为荧光定量PCR检测的靶标,设计引物和Taq Man探针,构建标准品,绘制标准曲线,评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度,并对138份粪便标本进行检测及测序验证。结果 3种病毒对应的标准曲线分别为:轮状病毒:y=-3.9lgx+41.204;诺如病毒GⅠ型:y=-3.06lgx+40.716;诺如病毒GⅡ型:y=-3.29lgx+41.538,质粒标准曲线的方差系数为0.997,灵敏度达到每个反应102copy/μl,特异度强。138份样本中检出A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的检出率分别为32.6%、5.8%和26.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建可用于A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。

荧光定量PCR与常规PCR法检测GⅡ型札幌样病毒的比较

目的比较荧光定量PCR与常规RT-PCR法检测牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的灵敏度与准确性,为该病毒检测提供适用的方法。方法采用荧光定量PCR和RT-PCR方法,分别检测牡蛎样品中的GⅡ型札幌样病毒。结果荧光定量PCR检测的灵敏度可达102拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有6例,阳性率为4.72%(6/127);RT-PCR的灵敏度为103拷贝/μl,札幌样病毒呈阳性的牡蛎有1例,阳性率为0.79%(1/127)。结论与RT-PCR方法比较,荧光定量PCR是更为敏感准确的方法,更适用于牡蛎中GⅡ型札幌样病毒的检测。

GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立快速准确的GⅡ型诺如病毒定量检测方法,本研究将微滴式数字RT-PCR技术应用于GⅡ型诺如病毒检测中,并与实时荧光RT-PCR法进行了比对。微滴式数字RT-PCR反应退火温度的优化实验确定了其最佳退火温度为56℃,实时荧光RT-PCR和微滴式数字RT-PCR两种方法的灵敏度实验对比表明微滴式数字RT-PCR法检测GⅡ型诺如病毒的灵敏度为5.40 copies/μL,其灵敏度高于实时荧光RT-PCR法,重复性实验对比表明两种方法在检测中间浓度的GⅡ型诺如病毒时重复性均较好;人工污染西生菜实验中表明微滴式数字RT-PCR法最低检测限为54.00 copies/μL。本研究建立的GⅡ型诺如病毒的微滴式RT-PCR检测方法,灵敏度高,重复性良好,在人工污染西生菜GⅡ型诺如病毒的检测中表现理想,具有良好的应用前景。

牡蛎中GⅡ型诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的优化与评价

为了解决目前巢式RT-PCR法检测牡蛎样品中GⅡ型诺如病毒时存在的非特异性扩增及假阴性等问题,对NCBI数据库中在线获得的所有GⅡ型诺如病毒序列进行系统分析,重新设计出针对GⅡ型诺如病毒检测的通用型巢式RT-PCR引物(NG2OF/NG2OR),并从基因型覆盖度、特异性、灵敏度和实际样品检测的稳定性几个方面对新设计的引物进行评估。结果显示:新引物的特异性好,只对GⅡ型诺如病毒进行有效扩增,且不受牡蛎样品本底的影响;新引物灵敏度高,最低可检测至26.4个拷贝;在对92个牡蛎样品进行检测时,新引物的阳性检出率为28.3%,比经典引物高出7.5%。因此,新建立的GⅡ型诺如病毒巢式RT-PCR检测方法在检测牡蛎样品时特异性更强,灵敏度更高,为牡蛎中诺如病毒的检测提供了一种新的、可靠的技术手段。