GⅡ.17型诺如病毒多克隆抗体的制备及应用

目的制备兔抗GⅡ.17型诺如病毒(GⅡ.17norovirus,GⅡ.17 NoV)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)多克隆抗体(兔抗GⅡ.17 NoV VLPs多克隆抗体),用其建立组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)-GⅡ.17 NoV VLPs阻断试验,并对其进行初步应用。方法制备并纯化GⅡ.17 NoV VLPs,采用SDS-PAGE、电镜观察和粒径检测方法对其进行鉴定。将其免疫家兔制备兔抗GⅡ.17 NoV VLPs多克隆抗体,经Western blot对其进行鉴定,并用ELISA检测其效价及特异性。筛选与GⅡ.17 NoV VLPs结合力强的唾液HBGA受体类型,优化GⅡ.17NoV VLPs质量浓度及多克隆抗体稀释度,用兔抗GⅡ.17 NoV VLPs多克隆抗体建立HBGA-GⅡ.17 NoV VLPs阻断试验,并进行特异性验证及初步应用。结果 GⅡ.17 NoV VLPs经检测纯度为95%,且颗粒形态完整,粒径均一。制备的多克隆抗体在Western blot可见特异性条带,效价可达1∶25 600 000,并对其他基因型(GⅠ.2、GⅠ.7、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.7)VLPs的交叉反应较弱。GⅡ.17 NoV VLPs和A、B、O和AB 4种血型的唾液HBGA均能结合,差异无统计学意义(P>0.05);以GⅡ.17 NoV VLPs质量浓度为0.25μg/m L,多克隆抗体的稀释度为1∶160 000建立了HBGA-GⅡ.17 NoV VLPs阻断试验,并应用该方法对不同剂量GⅡ.17 NoV VLPs免疫的小鼠血清进行了半数阻断滴度检测。结论成功制备了高效价兔抗GⅡ.17 NoV VLPs多克隆抗体,建立了HBGA-GⅡ.17NoV VLPs阻断试验,且该方法特异性良好,可用于GⅡ.17 NoV VLPs免疫效果的评价。

GⅡ.17型诺如病毒人源中和性单链抗体制备及生物特性鉴定

目的:基于一起暴发疫情,构建人源噬菌体单链抗体库,筛选特异性GⅡ.17型诺如病毒(NoV)单链抗体(scFv),并进行表达纯化及鉴定。方法:采集患者粪便或肛拭子样本,RT-PCR检测肠道病毒核酸,PCR扩增NoV衣壳蛋白N/S区和P区序列,Mega 4.0构建系统进化树。采集并分离患者恢复期外周血PBMC,Trizol提取总RNA;RT-PCR扩增抗体重轻链可变区基因,重叠扩增PCR将两者拼接为scFv基因,将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB-5E构建人源噬菌体单链抗体库。以GⅡ.17 P颗粒为固相抗原,对抗体库进行筛选及鉴定,将阳性克隆进行原核表达及纯化,ELISA鉴定其生物特性。结果:此次疫情中,83.3%(15/18)粪便或肛拭子样本呈GⅡ型NoV核酸阳性,经序列比对分析确定由GⅡ.17型感染导致;成功构建人源噬菌体单链抗体库,以GⅡ.17 P颗粒为抗原筛选得到11株序列不同且正确的阳性克隆;经原核表达获得9株与GⅡ.17 P颗粒具有良好亲和力的高纯度scFv,且与GⅡ.4和GI.3 P颗粒均有较好的特异性交叉反应,其中7株具有较强阻断GⅡ.17 P颗粒与HBGA受体结合的能力。结论:此次疫情为一次GⅡ.17型NoV引发的急性胃肠炎暴发,构建了人源噬菌体抗体库,经淘筛及表达纯化,最终获得9株GⅡ.17型NoV单链抗体,其中7株具有较强的中和能力。

基于杆状病毒表达系统制备的诺如病毒GⅡ.17型病毒样颗粒体液免疫原性研究

目的初步评价基于杆状病毒表达系统制备的诺如病毒(Norovirus,No V)GⅡ.17型病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫原性。方法制备并纯化No V GⅡ.17 VLPs,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophroesis,SDS-PAGE)、免疫印迹法(Western blot)、透射电镜和粒径检测方法对其进行鉴定。GⅡ.17型VLPs采用肌内免疫途径,免疫Balb/C小鼠。研究Al(OH)_(3)佐剂组4个免疫剂量(0.4、2、10、50μg)及不使用佐剂组3个剂量(0.4、2、10μg)的免疫应答。另外,设PBS、PBS加佐剂2个对照组。将每组的5只SPF级雌性健康Balb/c小鼠(6~8周龄)分别于0、3周进行初次免疫和加强免疫。于免疫前(第0天),初次免疫后3周(第21天),加强免疫后1周(第28天)、3周(第42天)分别眼眶采血。采用ELISA检测VLP-特异性Ig G抗体,组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)受体-VLPs结合阻断试验检测50%阻断滴度(50%of block‐ing titer,BT_(50))。组间特异性Ig G抗体水平和BT_(50)水平进行对数转换后,采用Two-way ANOVA法进行统计学处理。结果成功制备No V GⅡ.17 VLPs。经SDS-PAGE检测,No V GⅡ.17 VLPs纯度为95%,Western blot分析可见特异性条带,经透射电镜和粒径分析颗粒形态完整,粒径均一。2针肌内免疫后,疫苗不同剂量组(0.4、2、10μg)产生VLP-特异性Ig G抗体水平分别为4222、67559、135118;BT_(50)抗体水平分别为12.5、57.4、174.1,Al(OH)_(3)作为佐剂的不同剂量组(0.4、2、10μg)产生VLP-特异性Ig G抗体水平分别为12800、117627、409600;BT_(50)抗体水平分别为19.0、100.0、229.7,抗体水平明显高于无佐剂组(P均<0.05)。结论Al(OH)_(3)佐剂具有显著的免疫增强作用,肌内注射作为免疫途径,2针免疫,剂量高于2μg可产生较高的抗体Ig G和BT_(50)水平。应用含铝佐剂的GⅡ.17型VLPs免疫小鼠,诱生了较好的HBGA受体结合阻断抗体,可作为诺如病毒疫苗的组分抗原。

我国沈阳一起GⅡ.17型诺如病毒胃肠炎暴发的分子病原学特征研究

目的 明确沈阳地区一起学校急性胃肠炎暴发的病原和基因特征.方法 采集2015年12月沈阳地区某高校暴发疫情中的学生和食堂从业人员病例肛拭子标本共计15份,采用荧光定量RT-PCR进行诺如病毒检测,并对阳性标本进一步进行传统RT-PCR方法扩增、序列测定和系统进化分析.结果 荧光定量RT-PCR检测确定12份标本为诺如病毒阳性,系统进化分析表明,12个毒株均为GⅡ.17基因型,与引起我国2014-2015年流行的GⅡ.17新变异株KR020503株同源性为99％以上.结论 引起我国2014-2015年流行的GⅡ.17新变异株是引起此高校急性胃肠炎暴发的病原,并且GⅡ.17型诺如病毒为东北地区首次检出.

GⅡ.17型诺如病毒流行概况及分子进化特征研究进展

GⅡ.P17_GⅡ.17诺如病毒株是2014—2015年亚洲出现的变异株,其导致的疾病,在发病规模、感染人数、发病程度等方面,均盛于诺如病毒流行株GⅡ.4。虽是新毒株,但近年来,利用自组装病毒样颗粒蛋白(VLPs)系统对诺如病毒GⅡ.P17_GⅡ.17的研究比较多,包括病毒衣壳蛋白结构、受体结构、进化机制等方面。这些研究为诺如病毒引起的急性腹泻等相关疾病的预防控制和疫苗研制奠定了良好的理论基础。

3起GⅡ.17型诺如病毒突发疫情的分子流行病学分析

目的了解3起学校诺如病毒突发疫情的分子流行病学特征,分析诺如病毒疫情的基因型。方法采用实时荧光定量反转录PCR检测标本诺如病毒RNA,阳性标本进行逆转录PCR扩增、电泳、测序和进化树分析。结果 3起学校疫情的17份肛拭子样本中,诺如病毒GⅡ型阳性12份。10株疫情病毒经序列测定和比对,均为GⅡ.17亚型;与来自Gen Bank数据库的GⅡ.17亚型NV参考株相似性均在98%以上;系统发生树上与GⅡ.17基因亚型在一个进化分支上,属于GⅡ.17基因亚型。结论 GⅡ.17型诺如病毒将是今后疾病预防控制机构进行长效监测和防控的重点。

浙江省湖州市诺如病毒GⅡ.17型变异株的全基因组序列分析

目的分析浙江省湖州市检出的诺如病毒GⅡ.17型变异株的基因序列和系统发育与进化关系,为国内诺如病毒的遗传进化研究提供序列参考。方法根据GⅡ.17型诺如病毒保守序列,自行设计3对引物,扩增覆盖整个基因组的3个重叠片段,对来自急性胃肠炎病例的一株诺如病毒GⅡ.17型毒株进行全基因序列测定和系统发育和进化分析。结果在2015年3月湖州市急性胃肠炎病例标本中分离鉴定出一株诺如病毒株GⅡ.17[P17]变异株(毒株编号:NS15217),获得该病毒基因组全长7556 bp,编码3个开放阅读框(ORF),ORF1长5109 bp(5~5113 nt);ORF2长1623 bp(5094~6716 nt);ORF3长780 bp(6716~7495 nt)。湖州NS15217毒株在ORF1和ORF2中均属于GⅡ.17型基因型,且与LC037415.1/Hu/GⅡ.17/Kawasaki308和湖州MG692610毒株最接近。在VP1结构域中有106个插入/缺失/替换的残基,13个(12.3%)在S区,30个(28.3%)位于P1区;大多数替换和插入是位于P2域,有63个氨基酸(59.4%)。结论湖州地区2015年分离的诺如病毒GⅡ.17型变异株进化分支属于3b簇。其全基因组序列将有助于诺如病毒的遗传进化研究以及快速诊断试剂的研制。

一起GⅡ.17型诺如病毒引起的聚集性腹泻疫情报告

目的调查一起GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情。方法收集该起疫情患者粪便标本,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)检测诺如病毒核酸,阳性标本进行核苷酸序列测定并进行同源性分析。结果该起感染性腹泻疫情共36例患者,采集13例临床表现典型患者的粪便标本进行检测,诺如病毒核酸阳性8份,阳性率为61.54%。将5株测序成功序列进行比对,确定诺如病毒基因型为GⅡ.17型。与2014年中国香港分离的诺如病毒GⅡ.17型参考株Norovirus HK GⅡ.17 2014在同一个进化分支上,核苷酸序列同源性为99.3%~99.7%。结论本次疫情是由GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情,应加强对此毒株的监测工作。

一起GⅡ.17型诺如病毒感染性胃肠炎暴发疫情流行病学调查

目的调查一起聚集性胃肠炎事件暴发的病源、传播途径及危险因素,为有效控制疫情提供依据,为减少同类事件提供经验。方法制订病例定义并搜索,采取病例对照方法寻找可疑餐次及危险食物,采集样品进行核酸检测和分离培养。结果共搜索到疑似病例60例,确诊24例,流行曲线提示为点源暴露,2014年11月24日午餐是可疑餐次,该午餐中的客家秘制烧鸭是危险食物,邻座或共用工作卡座通道存在的接触是疫情扩散的因素,24例患者肛拭子标本经PCR检测,为诺如病毒核酸阳性,经鉴定为GⅡ.17型病毒株。结论该次疫情是一起GⅡ.17型诺如病毒导致的感染性胃肠炎暴发。

广西猕猴中发现GⅡ.17型诺如病毒及其全基因组序列分析

目的 了解广西省龙虎山猕猴粪便标本中的GⅡ.17型诺如病毒的流行情况、基因结构和进化特征.方法 2015年3月～8月收集400份野生猕猴粪便标本,利用建立好的HISEQ高通量测序技术在粪便标本中发现了GⅡ.17型诺如病毒,命名为GX213.采用反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术对其进行了序列鉴定、全长扩增和检测研究,并对三个开放阅读框（Open reading frames,ORFs）进行了序列和遗传进化分析.结果 筛查结果显示阳性率为0.5％ （2/400）.诺如病毒GX213毒株基因组全长为7 565 bp（包括PloyA尾）,其基因组分为三个ORFs：ORF1（10～5112nt）、ORF2（5093 ～ 6715 nt）和ORF3（6715 ～ 7494nt）,其中ORF1与ORF2之间重叠20 bp,ORF2和ORF3之间重叠1 bp.GX213病毒株全基因组序列分析显示,其与引起2014年至2015年亚洲部分地区暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株CUHK-NS-613（GenBank ID：KU561248）同源性最高（同源性最高为99.5％）.ORF1和ORF3区核苷酸和氨基酸序列都与CUHK-NS-613同源性最高（分别为99.5％,99.4％;99.5％,99.2％）.ORF2区分析序列发现其与CUHK-NS-491毒株（GenBank ID：KP698928）同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％和99.8％,仅P1.1区发现了一个氨基酸的突变aa245P→S.另外,RdRp核苷酸和VP1氨基酸序列进化树分析显示该病毒株与人GⅡ.17型诺如病毒CUHK-NS-613和CUHK-NS-491的进化关系最近,而与首次被发现的猴GⅡ.17型诺如病毒KM1509（GenBank ID：KX356908）次之.结论 本研究发现的GX213属于2014年至2015年在亚洲地区引起暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株,提示GⅡ.17型诺如病毒为人猕猴共患病毒.

GⅡ.17型诺如病毒样颗粒的制备及鉴定

[背景]诺如病毒(Norovirus,NoV)是引发全球人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,具有广泛的遗传多样性,其中GⅡ.17型是亚洲地区的优势流行株,危害最为严重。研究表明,通过基因工程技术制备的诺如病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)具有良好的免疫保护作用,是目前NoV疫苗研发的主要思路。[目的]利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统制备GⅡ.17型诺如病毒的VLP,为GⅡ.17型NoV疫苗的研发奠定基础。[方法]合成GⅡ.17型NoV衣壳蛋白VP1的基因并克隆入pET28a-MsyB原核表达质粒中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶去除融合标签,利用His-Tag镍柱纯化获得天然VP1蛋白,利用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜对纯化后的VP1蛋白反应原性及其形成的结构进行初步鉴定。[结果]MsyB-VP1融合蛋白能够以可溶形式大量表达,其最适表达条件为:IPTG浓度0.8 mmol/L,37℃诱导8 h;TEV蛋白酶酶切后的VP1纯化蛋白能够与鼠抗GⅡ.17型NoV VP1多克隆抗体特异性结合,并能够自组装形成直径约为40 nm的病毒样颗粒。[结论]利用原核表达系统成功制备了GⅡ.17型诺如病毒VLP,有望成为GⅡ.17型诺如病毒的候选疫苗。

一起厨工污染食物引起GⅡ.17型诺如病毒暴发疫情调查

目的调查珠海市某中学一起急性胃肠炎暴发疫情原因。方法开展病例搜索,用描述性流行病学和病例对照研究进行分析。采集样本用多重RT-PCR检测诺如病毒核酸、测定核苷酸序列。结果该校共发生诺如病毒感染性腹泻51例(学生49例、厨工2例),罹患率12.3%(51/416);主要症状为腹痛、恶心、呕吐、腹泻和发热,症状均较轻,呈自限性,病例无班级和宿舍聚集性,无重症病例;食堂就餐是危险因素(OR=8.46);39份标本(病例及厨工肛拭子、食堂食物留样、厨房自来水及学校直饮水)中,有31份检出诺如病毒核酸阳性(GⅡ.17基因型),证实疫情是由GⅡ.17诺如病毒引起急性胃肠炎暴发,污染食物是主要原因。结论冬春季是诺如病毒感染高发季节,学校是发生疫情的主要场所,污染食物是引起暴发的主要原因之一。应开展针对性健康教育,加强食堂监督管理,定期开展体检,杜绝从业人员带病上岗;疫情暴发流行期要加强外环境消毒,及时控制疫情。

GⅡ.17型诺如病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.17型诺如病毒(noroviruses,No V)单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法将小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0与经GⅡ.17 No V VLPs抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过替代性的中和试验筛选出阳性杂交瘤细胞,制备单克隆抗体并进行纯化,ELISA法检测单克隆抗体效价,SDS-PAGE法检测单克隆抗体纯度,BCA法检测单克隆抗体浓度,Biacore法检测单克隆抗体亲和力,亚型试剂鉴定单克隆抗体亚型,并进行各单克隆抗体与不同型NOV VLPs-唾液人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的交叉中和试验,单抗与不同型NOV VLPs结合能力的Western blot鉴定。结果筛选出3株具有中和活性的细胞株,分别命名为E12、B7、H7,纯化后的3株单克隆抗体效价均在106以上,浓度分别为6.932、2.662和2.371 mg/ml,亲和力常数KD均为10-9 mol/L,单克隆抗体E12的纯度在93%以上,属于Ig G2a亚型,单克隆抗体B7和H7的纯度分别在98%以上,属于Ig G1亚型。3株单克隆抗体仅对GⅡ.17型No V具有中和活性,对其他型的No V无中和活性,且与8种抗原均发生结合反应,但E12对8种抗原的结合能力较B7、H7差。结论已成功制备出抗GⅡ.17 No V的单克隆抗体,为进一步研究该病毒的生物学特性及疫苗的开发奠定了基础。

重组诺如病毒GⅡ．17型类病毒颗粒免疫学效果初步评价

目的 评价重组诺如病毒（Norovirus,NoV）GⅡ.17基因型VP1蛋白类病毒颗粒（virus like particle,VLP）的免疫学效果.方法 对纯化后的GⅡ.17型VP1 VLP进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用透射电镜和动态光散射对VLP大小、形态及粒径分布情况等进行检测,将GⅡ.17型VP1 VLP与含铝佐剂吸附后免疫BALB/c小鼠,利用酶联免疫吸附试验（enzyme linked im-munosorbent assay,ELISA）和组织血型抗原（histo-blood group antigen,HBGA）-VLP阻断试验检测小鼠血清特异性抗体水平和阻断抗体活性,并分析GⅡ.17型VP1 VLP蛋白免疫后血清与GⅠ.1和GⅡ.4 VP1 VLP蛋白的交叉反应和交叉阻断情况.结果 纯化后的重组NoV GⅡ.17型VP1 VLP蛋白纯度大于90％,Western blot检测到特异性条带.VLP直径在30-50 nm之间,形态良好,分布均匀,颗粒形态与天然病毒类似.免疫小鼠血清可检测到高滴度特异性抗体,且对GⅠ.1和GⅡ.4型VP1 VLP具有一定程度的交叉反应,但是无交叉阻断作用.结论 应用含铝佐剂的GⅡ.17型VP1 VLP免疫小鼠,可诱发较高滴度的HBGA阻断抗体,可作为诺如病毒疫苗的候选靶抗原.

诺如病毒67株基因分型

目的了解2014年苏州地区诺如病毒的感染状况及其基因型别。方法收集2014年苏州大学附属儿童医院疑似病毒性腹泻粪便标本322份，反转录（RT ）‐PCR定性检测G Ⅰ和G Ⅱ组诺如病毒，采用聚合酶区（A区）及衣壳蛋白区（C区）引物对诺如病毒阳性标本进行RT‐PCR扩增以鉴定诺如病毒基因型别。通过对相同样本不同区域测序分析得到比较全面的诺如病毒分子特征。结果322份粪便标本中，检测到67株诺如病毒G Ⅱ基因组，未检测到G Ⅰ基因组。A区测序成功42株，G Ⅱ．e型35株，GⅡ．7型3株，G Ⅱ．17型2株，G Ⅱ．12型2株；C区测序成功53株，G Ⅱ．4‐2012Sydney型44株， G Ⅱ．6型4株，G Ⅱ．17型2株，G Ⅱ．3型2株，G Ⅱ．2型1株。结论2014年苏州地区的诺如病毒以G Ⅱ．4‐2012Sydney亚型为主，同时发现G Ⅱ．17型毒株、G Ⅱ．7／G Ⅱ．6和G Ⅱ．12／G Ⅱ．3重组毒株。