实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。

GⅡ.4型诺如病毒的进化及疫苗研究进展

人诺如病毒（Noroviruses,No Vs）是杯状病毒科（Caliciviridae）的一种单链正股RNA病毒,是引起急性胃肠炎的主要病因,以GⅡ.4基因型最为流行.GⅡ.4型诺如病毒极易发生变异,每隔2~3年便可形成新的变异株,引起胃肠炎大范围流行,这与甲型流感病毒的流行特点相似.GⅡ.4型诺如病毒的进化机制涉及受体-组织血型抗原（HBGAs）、基因组空间、群体免疫、复制保真度等因素,这些因素共同影响GⅡ.4型的进化率.诺如病毒变异较快,使得诺如病毒疫苗的研发较为困难.但令人欣慰的是,目前基于GⅡ.4病毒样颗粒（VLPs）的疫苗研制进展顺利,有望在短期内面世;此外,诺如病毒体外感染模型的建立,使得减毒活疫苗与灭活疫苗的研发成为可能.

GⅡ.4型诺如病毒不同变异株与HBGAs结合模式分析

目的 了解GⅡ.4型诺如病毒不同变异株与受体人组织血型抗原（human histo-blood group antigens,HBGAs）的结合模式及HBGAs在GⅡ.4型诺如病毒进化过程中的角色.方法 利用RT-PCR方法扩增5株不同GⅡ.4型诺如病毒变异株的衣壳蛋白P区序列,在原核系统中表达并纯化P蛋白.通过一组HBGAs表型明确的唾液样本与P蛋白结合,进行唾液HBGAs结合模式分析.同时,将P蛋白与人工合成的HBGAs寡糖进行寡糖结合分析.结果 唾液HBGAs结合模式分析表明,Sakai变异株几乎不结合,其他GⅡ.4变异株的HBGAs结合模式相似,与分泌型唾液（A、B、AB和O型分泌型）结合,与O型非分泌型唾液不结合.95/96US变异株和2006b变异株结合能力较高,其次是Camberwell变异株,Hunter变异株较弱.寡糖结合分析与唾液结合分析结果一致,Sakai变异株不结合,其他毒株与均与分泌型寡糖（Ley和H1）结合,与非分泌型寡糖（Lea和Lex）不结合.95/96US变异株和2006b变异株与寡糖的结合能力较强,其次是Camberwell变异株.结论 绝大多数GⅡ.4型诺如病毒变异株与HBGAs结合模式相同,但结合能力不同,结合能力强的变异株流行范围较广.

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ.4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ.4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ.4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ.4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ.4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15.63~250 ng/mL,标准曲线R2均>0.98;准确性验证的加标回收率在72.23%~134.03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7.06%,中间精密性验证的RSD分别为8.04%和9.14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ.4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ.4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ.4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。

GⅡ.4 Sydney[P31]型诺如病毒GZ19株进化及其受体结合特征分析

目的分析我国GⅡ.4型诺如病毒(norovirus,NoV)GZ19株的进化特征,并明确其结合组织血型抗原(histoblood group antigens,HBGAs)受体的能力和方式。方法根据GZ19株中的ORF2区序列,构建进化树,并分析其在HBGAs结合位点(HBGA binding sites,HBSs)和关键阻断表位的氨基酸序列。采用原核表达系统表达P颗粒并进行纯化,获得的蛋白经SDS-PAGE和间接ELISA法鉴定后,采用唾液结合试验和寡糖结合试验分析P颗粒的糖结合特征。结果GZ19株属于GⅡ.4 Sydney[P31]谱系,其受体结合位点和阻断表位的氨基酸序列相对保守,与近5年其他GⅡ.4Sydney[P31]毒株具有较高的同源性,而与GⅡ.4 Sydney 2012原型株和GⅡ.4 Sydney[P16]株的差异较大。P颗粒仅与A、B、O、AB分泌型唾液和H-di寡糖结合。结论GZ19株代表目前GⅡ.4 Sydney[P31]NoV的进化方向,P颗粒的成功表达及其与HBGAs受体的结合特征分析,为研究我国GⅡ.4 NoVs的流行进化规律及疫苗开发奠定了基础。

贵阳地区GⅡ．4型诺如病毒变异株的初步研究

目的了解贵阳地区GⅡ．4型诺如病毒变异株的组成及其点突变。方法监测2010年6-11月于贵阳地区哨点医院就诊的急性胃肠炎病例，收集粪便标本，采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（real-timeRT—PCR）初步鉴定，随机选取部分GⅡ型诺如病毒阳性标本，采用一步法RT—PCR对其VP1基因区克隆及测序，基因序列与国内外流行的GH．4型诺如病毒进行系统进化及氨基酸位点的突变分析。结果检测标本426份，有267份（62．68％）GⅡ型诺如病毒阳性，测序获得了9份GⅡ．4型诺如病毒VP1基因组序列，贵州省2010年流行的GH．4型诺如病毒包括2个变异株（GH．42008a和GⅡ．42008b新型变异株），亚型组间的VP1基因的同源性为95．90％～96．72％，亚型组内同源性为99．45％～100％，有2个氨基酸位点易发生突变。结论贵阳地区2010年夏秋季急性胃肠炎以诺如病毒GH型为主，并且变异株具有多样性。

一起GⅡ.4[P16]型诺如病毒感染暴发疫情调查

目的分析2021年山东省某小区一起诺如病毒感染暴发疫情流行因素,为制定有效的防控措施提供科学依据。方法采用现场流行病学方法调查、分析疾病的流行情况,采集水样本、典型病例的粪便或呕吐物、密切接触者的肛拭子标本进行胃肠炎病毒检测,对阳性样本进行基因分型。结果搜索到病例69例(9例为小区内幼儿园儿童,60例为社区居民),临床表现主要为呕吐(76.81%),腹泻(69.57%)。0~5岁儿童罹患率最高(21.18%)。17份病例标本和2份密切接触者标本GⅡ组诺如病毒阳性,基因型均为GⅡ.4[P16]。结论本次事件是由GⅡ.4[P16]型诺如病毒引起的暴发疫情,是由患病儿童呕吐物造成环境污染,社区人员密切接触导致,及时识别和妥善处置是疫情防控的关键。

诺如病毒67株基因分型

目的了解2014年苏州地区诺如病毒的感染状况及其基因型别。方法收集2014年苏州大学附属儿童医院疑似病毒性腹泻粪便标本322份，反转录（RT ）‐PCR定性检测G Ⅰ和G Ⅱ组诺如病毒，采用聚合酶区（A区）及衣壳蛋白区（C区）引物对诺如病毒阳性标本进行RT‐PCR扩增以鉴定诺如病毒基因型别。通过对相同样本不同区域测序分析得到比较全面的诺如病毒分子特征。结果322份粪便标本中，检测到67株诺如病毒G Ⅱ基因组，未检测到G Ⅰ基因组。A区测序成功42株，G Ⅱ．e型35株，GⅡ．7型3株，G Ⅱ．17型2株，G Ⅱ．12型2株；C区测序成功53株，G Ⅱ．4‐2012Sydney型44株， G Ⅱ．6型4株，G Ⅱ．17型2株，G Ⅱ．3型2株，G Ⅱ．2型1株。结论2014年苏州地区的诺如病毒以G Ⅱ．4‐2012Sydney亚型为主，同时发现G Ⅱ．17型毒株、G Ⅱ．7／G Ⅱ．6和G Ⅱ．12／G Ⅱ．3重组毒株。