G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1发夹结构通过影响Paxillin的功能抑制成骨细胞迁移

目的探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(Gproteincoupledreceptorkinaseinteractingprotein1,GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞迁移的影响,并分析其机制。方法取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(greenfluoresenceprotein,GFP)的RNA发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12h后,再将每组分成有、无血小板源性生长因子(plateletdrivedgrowthfactor,PDGF)刺激的两组。免疫荧光染色方法检测成骨细胞内源性GIT1蛋白表达和Paxillin的位置。WesternBlot检测Paxillin的磷酸化。构建包含蓝色荧光蛋白的GIT1-RNAh(CFP-GIT1-RNAh)实验组和GFP-RNAh(CFP-GFP-RNAh)(对照组),免疫荧光双染的方法检测CFP-GIT1-RNAh和CFP-GFP-RNAh对Paxillin位置的特异性作用。用划痕愈合法检测GIT1-RNAh(实验组)和GFP-RNAh(对照组)腺病毒对成骨细胞在PDGF刺激下的迁移能力的影响。结果免疫组织化学观察,实验组和对照组比较,明显抑制成骨细胞内源性的GIT1蛋白表达和扰乱Paxillin的分布。WesternBlot观察,和对照组相比,实验组明显抑制了Paxiliin的磷酸化(P<0.05)。划痕愈合法检测观察,和对照组相比,实验组明显抑制成骨细胞的迁移。结论GIT1-RNAh通过扰乱Paxillin的分布和其磷酸化从而抑制成骨细胞的迁移。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白功能特征与相关疾病研究进展

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)作为最大的一类膜蛋白受体家族,可被多种配体激活并发挥相应的信号转导功能,参与生物体内重要的生理过程。G蛋白偶联受体相关分选蛋白(G protein-coupled receptors associated sorting proteins,GASPs)则对内吞后的GPCRs分选过程发挥着重要的作用,并介导受体进入降解或再循环途径,进而调控细胞的信号转导等过程。研究发现GASPs的功能缺陷与多种疾病相关,包括神经系统疾病、肿瘤和耳聋等。本文重点介绍了G蛋白偶联受体相关分选蛋白的功能特征及其相关信号通路,描述了GASPs功能缺陷与疾病的关联性及家族蛋白与GPCRs的相互作用、GASPs分选途径的发现、参与的信号通路及对基因转录调控,以期为GASPs相关多种疾病的治疗提供新的思路和策略。

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6通过Wnt/β-连环蛋白通路对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6(LGR6)对人结肠癌SW480细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法在结肠癌细胞株SW480细胞中构建低表达LGR6的实验组、阴性对照组和空白对照组,用实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)验证LGR6 mRNA和蛋白的表达水平。用MTT法检测细胞增殖活性,用Transwell小室法检测细胞的侵袭能力,用Western Blot检测Wnt/β-连环蛋白(βcatenin)信号通路相关蛋白表达水平。结果实验组、阴性对照组和空白对照组LGR6 mRNA表达水平分别为(0.42±0.08)、(1.12±0.08)、(1.13±0.31),转染LGR6 siRNA的SW480细胞LGR6 mRNA和蛋白表达水平显著降低(均P<0.05);转染后24、48、72 h时实验组细胞增殖活性[(0.24±0.04)、(0.27±0.06)、(0.45±0.08)、(0.63±0.09)]显著低于阴性对照组[(0.22±0.03)、(0.40±0.05)、(0.92±0.07)、(1.32±0.11)]和空白对照组[(0.26±0.04)、(0.42±0.07)、(0.94±0.09)、(1.21±0.12),均P<0.05]。下调LGR6表达可促进结肠癌细胞Bax和Cleaved caspase 3蛋白的表达,并抑制结肠癌细胞βcatenin和c-Myc蛋白的表达(均P<0.05)。结论下调LGR6可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌SW480细胞的增殖和侵袭,并促进结肠癌SW480细胞的凋亡。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白研究进展

G 蛋白偶联受体（G Protein-coupled Receptors,GPCRs）是人类基因组编码的最丰富的一类膜蛋白家族.GPCRs 可被包括气体、光子、氨基酸及其衍生物、Ca2 ＋ 、肽、脂类物质和大量的糖蛋白激素等在内的多种配体激活,进而引发细胞信号转导,参与调节人体心血管系统、免疫系统和神经系统等在内的几乎所有的生理过程.

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)参与免疫调控的研究进展

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(GIT2)是一类多结构域的信号支架蛋白。GIT2通过与不同蛋白质的相互作用调节细胞功能,主要参与整合素介导的细胞黏附、肌动蛋白细胞骨架组装以及胞内信号传递过程。GIT2在免疫系统中也扮演着重要角色,促进中性粒细胞趋化性,抑制其过度产生超氧化物,促进胸腺细胞的阳性选择和趋化性,抑制炎症性肠病,介导肝脏免疫性损伤,且GIT2敲除小鼠具有多种免疫缺陷症状。本文简述了GIT2在免疫体系中的调控作用。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白1在非小细胞肺癌中表达的临床意义及其与顺铂化疗抵抗的关系

目的探究G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GPRASP1)的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的顺铂(DDP)敏感性的关系。方法收集癌旁组织、原发NSCLC组织及复发NSCLC组织,用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GPRASP1和腺苷三磷酸结合盒式亚家族A成员5(ABCA5)mRNA的表达情况。空白组和过表达组分别用慢病毒转染空白载体和GPRASP1过表达载体于A549细胞中;对照组和抵抗组分别用慢病毒转染对照小干扰RNA(si-control)于A549细胞及DDP耐药细胞中;干扰组用慢病毒转染GPRASP1小干扰RNA(si-GPRASP1)于DDP耐药细胞中。用CCK-8实验法检测细胞对DDP的半抑制浓度(IC50),用RT-PCR法检测各组细胞中GPRASP1与ABCA5的表达情况。结果癌旁组织、NSCLC组织与复发NSCLC组织中GPRASP1 mRNA表达量分别为(1.27±0.16)×10^(-2)、(2.68±0.30)×10^(-2)和(3.89±0.72)×10^(-2),ABCA5 mRNA表达量分别为(1.03±0.13)×10^(-1)、(1.85±0.21)×10^(-1)和(2.67±0.61)×10^(-1);复发NSCLC组织中GPRASP1和ABCA5 mRNA表达量均显著高于癌旁组织及NSCLC组织,差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组和过表达组的GPRASP1 mRNA表达量分别为1.00±0.16和5.98±0.66,ABCA5 mRNA表达量分别为1.00±0.09和2.81±0.33,DDP IC50分别为(2.10±0.13)和(3.50±0.11)μmol·L^(-1),差异均有统计学意义(均P<0.01)。对照组、抵抗组和干扰组的GPRASP1 mRNA表达量分别为1.00±0.11、3.37±0.31和0.81±0.13,ABCA5 mRNA表达量分别为1.00±0.10、4.06±0.43和2.30±0.25,DDP IC50分别为(2.08±0.13)、(7.87±0.61)和(5.77±0.55)μmol·L^(-1);抵抗组的上述指标与对照组和干扰组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论GPRASP1可显著促进ABCA5的表达,并介导NSCLC DDP抵抗。

GIT1蛋白通过调节血管形成促进骨折愈合

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)在骨折愈合过程中的作用。方法:应用GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只。造模成功后7、14、21 d,应用X线、micro-CT、PECAM1免疫荧光染色等方法分析骨痂体积及新生血管情况。结果:与野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟,骨痂内新生血管的体积和数量减少。结论:GIT1基因缺失导致骨痂区新生血管减少,从而延迟骨折愈合。

血清sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1在非小细胞肺癌患者中的表达及相关性分析

目的探讨血清可溶性MHC-I类链相关蛋白A(sMICA)、增殖细胞核抗原(PCNA)、G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达及与病理分型的相关性。方法2020年7月至2022年8月诊治的86例NSCLC患者作为研究对象,并设立为观察组,同期选取43例健康体检者设立为对照组;并根据不同病理分型将观察组分为腺癌组(n=33)和鳞癌组(n=53),对比血清sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1;并采用Logistic回归模型分析sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1对非小细胞肺癌的影响;采用ROC曲线模型分析sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1诊断非小细胞肺癌的AUC、敏感度及特异度。结果观察组的sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1均高于对照组(P<0.05)。腺癌组的sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1均高于鳞癌组(P<0.05)。二元Logistic回归模型分析显示,sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1高表达会对非小细胞肺癌的发生产生影响(P<0.05)。ROC曲线分析显示,sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1及四项联合诊断NSCLC的AUC值分别为(0.750、0.654、0.819、0.788、0.843,P均<0.05),敏感度分别为57.00%、46.50%、67.40%、90.70%、79.10%;特异度分别为93.00%、93.00%、88.40%、58.10%、86.00%。结论sMICA、PCNA、GASP-1、TIMP-1在NSCLC患者中呈高表达趋势,其表达水平会随病理分型而升高。

支架蛋白GIT2通过与Smad3相互作用调节其转录活性

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins 2,GIT2)是一种信号支架蛋白,可募集多种信号通路的关键分子,参与肌动蛋白细胞骨架组装、整合素介导的细胞粘附、G蛋白偶联受体的内化及胞内信号传递等生物学过程.采用酵母双杂交实验证明,TGF-β1信号通路的转录因子Smad3是GIT2的相互作用蛋白质,内、外源免疫共沉淀实验均证实,GIT2与Smad3存在蛋白质相互作用.报告基因实验及免疫印迹结果表明,GIT2增加Smad3的转录活性并增强TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化.研究还发现,Git2-/-小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的Smad3磷酸化受到抑制,其骨形成相关靶基因的表达水平也低于Git2+/+小鼠.本研究表明,GIT2通过与Smad3的相互作用调节其转录活性并活化TGF-β1信号通路,可能参与调节骨髓间充质干细胞的分化.

肺癌患者GASP-1、LCN2和TPX2的表达水平及其与TNM分期和预后的相关性分析

目的探究肺癌患者血清G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)、脂质运载蛋白-2(LCN2)、Xklp2靶蛋白(TPX2)表达水平及其与TNM分期和预后的相关性。方法选取2019年4月至2022年5月在南部战区总医院接受诊疗的92例肺癌患者作为观察组,同期选取92例健康体检者作为对照组。采集所有研究对象的外周静脉血样,检测血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平。将观察组按预后情况分为预后良好组和预后不佳组,比较2组患者血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平。分析肺癌患者血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平与TNM分期和预后的相关性。结果观察组血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平高于对照组(P<0.05);观察组TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期的肺癌患者血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平高于TNM分期为Ⅰ、Ⅱ期的肺癌患者(P<0.05),TNM分期为Ⅳ期的患者血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平均高于TNM分期为Ⅲ期的患者(P<0.05)。预后良好组血清GASP-1、LCN2、TPX2水平均低于预后不佳组(P<0.05);观察组治疗前血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平均与TNM分期呈正相关(P<0.05),治疗后血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平均与预后呈负相关(P<0.05)。结论血清GASP-1、LCN2、TPX2表达水平与肺癌患者的TNM分期相关,在对症治疗后检测上述血清指标,可在一定程度上反映患者预后情况,为临床提供参考。

ShRNA干扰G蛋白偶联受体相关分选蛋白1对肺癌细胞增殖凋亡和裸鼠成瘤影响

目的探讨shRNA干扰G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)对肺癌细胞增殖凋亡和裸鼠成瘤影响。方法将GASP-1-shRNA1、2和3用Lipofectamine 2000转染到肺癌A549细胞。选择转染GASP-1-shRNA1的细胞,建立空白对照组、空载体转染组和GASP-1-shRNA1转染组,采用菌落形成试验和流式细胞术分别检测肺癌A549细胞增殖和调亡;采用Western Blot检测ki67、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。将转染GASP-1-shRNA1细胞注射裸鼠后腿建立原位异种移植小鼠模型。检测肿瘤的生长,并通过免疫组化检测ki67和caspase-3蛋白表达量。结果GASP-1-shRNA1、2和3转染A549细胞后GASP-1 mRNA和蛋白表达量均显著下调,尤其转染GASP-1-shRNA1组。GASP-1下调能抑制A549细胞增殖,并促进A549细胞凋亡;在体内试验中,下调GASP-1能抑制体内肿瘤生长,同时也能抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论GASP-1的下调可抑制肺癌细胞增殖、促进凋亡,并抑制肿瘤生长。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白1对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响

目的 探讨G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响。方法 将乳腺癌MDA-MB-231细胞分别三组,分别为空白对照组(转染shNC)、shRNA组(转染shRNA)和shGASP组(转染shGASP-1)。qRT-PCR检测GASP-1 mRNA水平,Western blot检测GASP-1蛋白水平,CCK-8检测MDA-MB-231细胞增殖;克隆形成实验检测MDA-MB-231细胞克隆形成能力,Transwell法检测MDA-MB-231细胞迁移能力,流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡。结果 三阴性乳腺癌组织中GASP-1mRNA的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。与空白对照组和shRNA组相比,shGASP组中的GASP-1 mRNA和蛋白显著降低(P<0.05);48~72 h,shGASP组中MDA-MB-231细胞增殖能力显著低于空白对照组(P<0.05);与空白对照组和shRNA组相比,shGASP组中的MDA-MB-231细胞克隆形成能力明显降低(P<0.05);shGASP组中的MDA-MB-231细胞侵袭明显降低(P<0.05);shGASP组中MDA-MB-231细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论 沉默GASP-1可以抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭,促进其凋亡,提示GASP-1可能与三阴性乳腺癌的发生发展密切相关,有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1对BMSCs向内皮细胞分化的影响机制研究

目的通过比较G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型及GIT1基因敲除型小鼠BMSCs向内皮细胞分化过程,探讨GIT1影响血管形成的机制。方法 GIT1杂合子小鼠雌雄配对饲养,对获得的新生小鼠采用PCR法行基因型鉴定。取GIT1野生型与GIT1基因敲除型小鼠胫骨及股骨,分离培养BMSCs并传代。取第2代BMSCs分为4组,分别为野生型对照组(A组)、野生型实验组(A1组)、基因敲除型对照组(B组)、基因敲除型实验组(B1组);A1、B1组细胞采用内皮细胞诱导液培养,A、B组细胞进行常规培养。Western blot检测各组细胞VEGF受体2(VEGF receptor 2,VEGFR-2)、VEGFR-3、磷酸化VEGFR-2(phospho-VEGFR-2,p VEGFR-2)、p VEGFR-3蛋白表达;流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)、血小板内皮细胞黏附因子1(platelet-endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM-1)、血管内皮黏钙蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-Cadherin)表达。另取GIT1野生型小鼠第2代BMSCs分为4组:Ⅰ组,原细胞培养液培养;Ⅱ组,细胞培养液中加入VEGFR-3阻断剂SAR131675;Ⅲ组,内皮细胞诱导液培养;Ⅳ组,内皮细胞诱导液中加入SAR131675。流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物v WF、PECAM-1、VE-Cadherin表达。结果 Western blot检测示,A、A1、B、B1组细胞的VEGFR-2、p VEGFR-2蛋白表达无明显差异,A1组VEGFR-3、p VEGFR-3蛋白表达明显高于其余3组。流式细胞仪检测示,A1组v WF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于A、B、B1组,B1组显著高于A、B组(P<0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。阻断VEGFR-3实验中,Ⅲ组v WF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组,Ⅳ组高于Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GIT1通过VEGFR-3影响小鼠BMSCs向内皮细胞分化,进而影响血管形成。

机械应力调控血管平滑肌细胞的凋亡

背景:随着生物力学的发展,其在心血管疾病中的研究也日益广泛,通过研究血管的力学特性可以有效地揭示动脉粥样硬化、再狭窄等心血管疾病的发病机制,开发心血管疾病治疗的新思路和新方法。目的:综述机械应力刺激对血管平滑肌细胞凋亡的研究现状,寻找临床治疗潜在靶分子和信号通路,以期改善临床动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病的临床治疗效果。方法:检索1992年1月至2023年5月在中国知网、PubMed及ScienceDirect数据库收录的文献。中文检索词为“血管平滑肌细胞,机械应力,剪切力,牵张力,凋亡”;英文检索词为“vascular smooth muscle cell,mechanical stress,shear stress,stretch stress,apoptosis”,最终纳入63篇文献进行综述分析。结果与结论:①血管平滑肌细胞的生理性和病理性凋亡都是为了适应血管力学变化而发生的适应性重构。不同部位的平滑肌细胞承受不同的力学刺激,其发病机制也不同。②低剪切力、生理剪切力和高剪切力可通过直接与平滑肌细胞表面分子、受体及蛋白等作用调控凋亡信号分子和抑制增殖实现对血管平滑肌细胞凋亡的调控,该部分未对促进增殖的研究进行综述。③低牵张力、生理牵张力和高牵张力可导致平滑肌细胞凋亡,但仍存在争议。平滑肌表面存在多种力学感受分子(如整合素及受体络氨酸激酶等)可以将力学信号转导为细胞内的化学信号(如Hippo通路),启动平滑肌细胞的凋亡信号,调控平滑肌细胞的凋亡。④总之,不同力学刺激通过多种信号分子,启动多个信号通路共同作用,调控平滑肌细胞的凋亡,例如剪切力主要通过刺激分泌前列腺素、转化生长因子等影响Fas/FasL、Akt通路;而牵张力主要通过Yes相关蛋白等调控YAP通路和Notch通路等。这些分子在不同的作用时间,或不同作用强度下可能发挥相反的双向作用,比如,小鼠血管平滑肌细胞受到10%生理牵张1 h时,其增殖增加;然而,人的血管平滑肌细胞牵张12 h后可以减少其增殖。临床可以通过寻找其关键作用时间点干扰力学转导关键分子,达到预防和治疗临床心血管疾病的目的。

肺浸润性腺癌中GASP-1的表达及意义

目的:观察肺浸润性腺癌中G蛋白偶联受体相关分选蛋白1(GASP-1)的表达,探讨其在术后组织中表达的临床意义,分析血清及术后组织中表达的一致性。方法:选择2014年09月至2015年03月确诊为肺浸润性腺癌并行根治手术的患者59例作为研究对象,选择肿瘤组织作为观察组,选择肺原位腺癌59例作为对照组,选择正常肺组织59例作为正常对照组。应用免疫组化法检测三组中GASP-1、观察组中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;构建过表达GASP-1肺腺癌A549细胞系,建立空白对照组和GASP-1过表达组,应用Western Blot法检测PCNA的表达。应用ELISA法检测观察组术前空腹静脉血中GASP-1的表达。结果:三组中GASP-1表达的阳性率差异有统计学意义,GASP-1在不同肿瘤最大径、肺膜侵犯及淋巴结转移分组表达的阳性率中差别有统计学意义;GASP-1的表达与生存时间有关,与PCNA具有正相关性,过表达GASP-1的肺癌细胞系中PCNA表达升高;观察组血清和组织中GASP-1的表达具有正相关性。结论:肺浸润性腺癌中GASP-1高表达,对病变的形成和进展有促进作用,GASP-1可能通过调控细胞增殖发挥促进肿瘤进展的作用,术后检测GASP-1的表达对判断预后有一定价值。血清和组织中GASP-1的表达具有一致性。

GIT1通过BMP-2/p-Smad1/5/8信号通路调节骨折愈合

目的 :探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G-protein coupled receptor kinase-interacting protein 1,GIT1)影响骨折愈合的具体机制。方法:分别取GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只。造模成功后2周,免疫组化检测骨痂区软骨细胞矿化及p-Smad1/5/8表达量。分别取2组小鼠的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),予以10 ng/m L的骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)刺激后检测Smad1/5/8磷酸化水平和核转入能力;取C3H10T1/2细胞,分别用1μg p GL3重组质粒和1μg GIT1-si RNA共转染细胞,荧光报告素酶技术检测细胞内GIT1蛋白对BMP2转录水平的影响。结果:与同窝野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠软骨内骨化减弱,骨痂区软骨细胞堆积,骨折愈合延迟,p-Samd1/5/8表达水平明显减少;与GIT1基因敲除小鼠相比,BMP2可明显提高同窝野生型小鼠BMCs中p-Samd1/5/8核转入能力;GIT1蛋白表达的缺失可明显降低BMP2的转录水平。结论 :GIT1可通过调节Samd1/5/8的磷酸化及BMP2信号转导影响骨折部位的软骨内骨化。

GIT1发夹结构干扰MLC的分布及其磷酸化

目的:探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1,GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞内肌球蛋白轻链(myosinlightchain,MLC)的分布及磷酸化的影响,并分析其机制。方法:取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12h,再将每组分成有、无血小板衍生生长因子(platelet-drived growth factor,PDGF)刺激的两组,免疫荧光染色方法检测成骨细胞内MLC的位置,Western blot检测MLC的磷酸化。结果:免疫组织化学观察:和对照组相比,实验组明显扰乱了成骨细胞MLC的分布;Western blot观察:和对照组相比,实验组明显抑制了MLC的磷酸化(P<0.05)。结论:GIT1的发卡结构过表达可干扰MLC的分布和其磷酸化。

GIT1-WT及GIT1-Y293F慢病毒载体的构建及其对成骨细胞迁移能力的影响

目的:设计构建G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型(WT)及点突变型(Y293F)慢病毒载体,探讨293位点对GIT1功能的影响。方法:用PCR从小鼠cDNA文库中扩增GIT1-WT,将其连接到慢病毒载体PLJM-GFP中,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-WT,测序鉴定。利用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒,对PLJM-GFP-GIT1-WT进行定点突变,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-Y293F,测序鉴定。重组慢病毒载体转染包装细胞293T,获取病毒上清感染培养至第4代的小鼠成骨细胞。划痕愈合试验检测成骨细胞迁移能力的变化。结果:通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,成功构建了PLJM-GFP-GIT1-WT与PLJM-GFP-GIT1-Y293F。划痕愈合试验观察,与PLJM-GFP-GIT1-WT相比,PLJM-GFP-GIT1-Y293F明显抑制成骨细胞迁移。结论:GIT1功能的正常发挥有赖于293位点适时的磷酸化。

香菇多糖抑制肝癌细胞HepG2增殖的作用及其可能机制

目的探讨香菇多糖(Lentinan,LNT)对肝癌细胞Hep G2增殖的影响及机制。方法体外培养肝癌细胞系Hep G2分别给予不同浓度LNT处理,MTT法检测肝癌细胞增殖抑制率的变化,western-blot检测轴突导向蛋白4C(Sema4C)和G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1(GIT1)表达。结果不同浓度LNT作用肝癌细胞24、48、72 h后,肝癌细胞增殖的抑制率呈现浓度和时间依赖性;western-blot检测发现100μg/ml香菇多糖处理肝癌细胞48 h后,Sema4C和GIT1表达明显低于对照组(P<0.05)。结论LNT能够抑制肝癌细胞增殖,其机制可能是通过下调Sema4C和GIT1蛋白表达。

Git2在胆管癌组织中的表达和意义

目的探讨Git2在胆管癌组织中的表达。方法采用免疫组化技术检测Git2在胆管癌和胆管癌癌旁组织中的表达。所获数据采用x2检验。结果胆管癌组织中的Git2阳性表达率(72.90%)明显高于胆管癌癌旁组织(50.80%)(P<0.01)。在胆管癌组中Git2在低、中、高分化癌组织中阴性表达率分别为88.9%(24/27)、75%(15/20)、33%(4/12),三者均有显著差异,淋巴结转移患者中Git2阳性表达率为85.60%(33/39),高于未发生转移的组织50.00%(10/20),差异有显著性(P<0.05)。结论 Git2可能与胆管癌的病理分化及淋巴结转移有关。