G-蛋白偶联受体的功能测定和高通量药物筛选

G 蛋白偶联受体家族是药物开发中最大的一类药物靶点 ,高通量药物筛选是开发药物早期阶段的最重要工具之一。根据G 蛋白偶联受体与配体结合及激发的信号通路 ,人们设计了各种可行的功能测试方法 ,用于G 蛋白偶联受体为药靶的高通量药物筛选 ,如 :微体积荧光数字图像测定技术 (Fluorometicmicrovolumeassaytechnology ,FMAT)、荧光偏振 (Fluoresencepolarization ,FP)、竞争性ELISA (Com petitiveenzyme linkedimmunosorbent)、闪烁邻近测定法(Scintillation proximityassay ,SPA)、载黑色素细胞测定法(Melanophoreassay)、报告基因测定法 (Reportergeneassay)和钙离子测定法等测定方法。在这些方法中 ,报告基因测定法和钙离子测定法占了主导地位。非放射性、无需底物和辅助剂的报告基因测定方法和荧光钙离子指示剂的钙离子测定方法可能是将来G

G-蛋白偶联雌激素受体在肾阴虚和肾阳虚小鼠睾丸中的表达及其与生殖功能的关系

目的:探讨肾阴虚与肾阳虚雄性小鼠睾丸G-蛋白偶联雌激素受体(GPER)的定位与表达,及其对肾阴虚与肾阳虚雄性小鼠生殖功能的影响。方法:将6周龄雄性昆明小鼠随机分为正常组、肾阳虚组和肾阴虚组。采用矿场实验、高架十字迷宫、游泳力竭等评价小鼠精神萎靡程度和自主活动次数等行为学改变;电化学发光法检测睾酮(T)和雌二醇(E2),并计算T/E2;全自动精子分析仪检测精液质量;与雌鼠合笼后记录雌鼠产仔数,计算雄鼠平均育仔数;免疫组织化学和免疫荧光染色检测GPER在小鼠睾丸中的定位和表达。结果:与肾阴虚组比较,肾阳虚组小鼠开臂进入次数百分率和中央区进入次数明显减少,同时,游泳力竭时间缩短更为明显(P<0.05),但开臂滞留和中央区滞留时间百分率无明显差异(P>0.05)。与肾阴虚组比较,肾阳虚组小鼠附睾精子计数和活动精子百分率明显减少,且育仔数显著下降(P<0.05);精子畸形率略有升高(P>0.05);血清T水平明显降低(P<0.05),E2水平略有下降(P>0.05),T/E2明显下降(P<0.05)。肾阴虚和肾阳虚小鼠睾丸GPER均表达于睾丸间质细胞的细胞质内,细胞核和细胞膜表达为阴性,肾阳虚小鼠睾丸GPER的表达显著高于肾阴虚组(P<0.05)。结论:肾阳虚与肾阴虚小鼠均出现精子数量与育仔数下降,精子畸形率增加,但以肾阳虚小鼠更为明显,这种改变可能与肾阳虚小鼠睾丸GPER表达增加有关,从而造成血清T水平及T/E2比值下降。

糖尿病心肌病患者与抗G-蛋白偶联型受体血管紧张素Ⅱ1型受体和肾上腺素能α_1受体自身抗体的初步研究

目的 :探讨抗G 蛋白偶联型受体血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1受体 )和肾上腺素能α1受体 (α1受体 )自身抗体是否与糖尿病心肌病发病有关。方法 :以合成的AT1与α1受体多肽片段为抗原 ,应用酶联免疫吸附测定技术 ,检测 196例住院及门诊体检者血清中抗G 蛋白偶联型受体AT1和α1受体自身抗体 ,其中糖尿病心肌病患者 46例 (糖尿病心肌病组 ) ,2型糖尿病 5 2例 (糖尿病组 ) ,高血压无靶器官受损患者 5 8例 (高血压组 )及正常对照组 40例。结果 :糖尿病心肌病组抗AT1受体自体抗体阳性率和抗α1受体自身抗体阳性率 ,明显高于糖尿病组、高血压组以及正常对照组 ,有显著性差异 (P均 <0 .0 5～ 0 0 1)。结论 :免疫学机制可能参与糖尿病心肌病病理生理过程。

胆汁酸G-蛋白偶联受体通过p38 MAPK通路诱导巨噬细胞IL-1β、TNF-α和IL-6的转录

目的观察胆汁酸G-蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor for bile acids,TGR5)被齐墩果酸(oleanolicacid,OA)激活后对RAW264.7细胞白细胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)转录的影响及其机制的探讨。方法通过实时荧光定量(Real-time)PCR法检测OA作用不同时间RAW264.7细胞和原代枯否细胞IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达;并进一步分析在RAW264.7细胞中加入3种不同信号通路的抑制剂对上述3种炎症因子mRNA表达的影响。OA作用RAW264.7细胞和原代枯否细胞不同时间后,Western blot分析p38 MAPK的磷酸化水平。结果 OA刺激RAW264.7细胞6、12、24 h后,IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达明显升高。OA作用于分离的原代枯否细胞3 h和6 h后,也可观察到相同的结果。p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可以明显地抑制OA诱导的RAW264.7细胞内IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达,但PKA和NF-κB的抑制剂无此作用。RAW264.7细胞和原代枯否细胞经OA刺激后,p38 MAPK磷酸化水平明显增强。结论 TGR5可能通过活化p38 MAPK磷酸化诱导炎症细胞IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达,提示TGR5在无其他刺激因素作用下,具有诱导炎症因子表达的作用。

冠心病患者血清抗G-蛋白偶联受体自身抗体的分布特性

目的探讨冠心病患者血清中抗G-蛋白偶联受体自身抗体的分布特征。方法选择冠心病患者131例,正常健康体检者100名,采用链酶亲和素-酶联免疫吸附试验(SA-ELISA)测定其血清中抗G-蛋白偶联型β1AR、Μ2R、α1AR自身抗体。结果①冠心病患者血清抗G-蛋白偶联型β1AR、Μ2R、α1AR自身抗体的阳性率分别为20.6%(27/131)、16.8%(22/131)、39.7%(52/131),明显高于正常对照组的7.0%(7/100)、8.0%(8/100)、15.0%(15/100)(P<0.05);②冠心病组抗β1AR、Μ2R、α1AR自身抗体阳性患者的平均抗体滴度分别为1:(87.3±3.1)、1:(92.5±2.4)、1:(101.2±2.6),明显高于正常对照组的1:(14.6±2.7)、1:(21.4±2.2)、1:(26.6±3.8)(P<0.01)。结论冠心病患者血清中不仅存在抗G-蛋白偶联型β1AR、Μ2R和α1AR自身抗体,而且抗体阳性率和滴度也明显高于正常对照组,提示这些自身抗体的出现及其介导的自身免疫反应可能参与冠心病的病理生理过程。

G-蛋白偶联受体124与舌鳞癌的相关性研究

目的:研究G-蛋白偶联受体124(GPCR124)在人舌鳞状细胞癌(TSCC)中的表达及其与患者临床病理指标及预后的关系。方法:收集南通大学附属医院及南通市肿瘤医院手术切除的TSCC组织标本,行第2代高通量测序鉴定、生物信息学分析,并筛选出TSCC相关基因GPCR124。蛋白质印迹法检测8对新鲜冰冻TSCC组织与邻近癌旁组织中GPCR124蛋白的表达;免疫组化SP法检测73例TSCC石蜡标本中GPCR124蛋白的表达水平,结合随访资料,分析GPCR124表达与临床病理指标及患者预后的相关性。结果:高通量测序结果显示TSCC组织较之配对癌旁组织中circ_0000231表达明显上调。蛋白质印迹法显示GPCR124蛋白在TSCC组织中明显高表达,而在配对癌旁组织中表达较低,其表达水平与肿瘤的分化程度(P=0.019)、临床分期(P=0.011)密切相关。Log-rank单因素分析结果显示肿瘤分化程度(P=0.000)、临床分期(P=0.000)与TSCC患者的生存预后相关,GPCR124表达水平低的患者生存率高于GPCR124表达水平高的患者。Cox风险回归模型的多因素分析显示,肿瘤的分化程度(P=0.038)、GPCR124表达水平(P=0.034)及临床分期(P=0.041)等均是TSCC预后不良的独立影响因素。结论:高通量测序及生物信息学分析表明GPCR124可能成为circ_0000231下游的靶向分子;GPCR124可能成为TSCC预后的一个独立影响因素,其高表达与TSCC的发生发展密切相关。

不同浓度短链脂肪酸对奶牛瘤胃上皮细胞免疫反应、紧密连接蛋白和G-蛋白偶联受体41表达的影响

本试验旨在研究不同浓度短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞(BRECs)免疫反应、紧密连接蛋白和G-蛋白偶联受体41(GPR41)表达的影响以及GPR41与促炎症因子、趋化因子和紧密连接蛋白之间的关系。试验设计4个试验组,分别用20、50、100和150 mmol/L SCFAs培养BRECs 24 h后提取总RNA,每组3个重复。结果显示:1) SCFAs浓度为100和150 mmol/L SCFAs时,促炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA相对表达量显著高于SCFAs浓度为20和50 mmol/L时(P<0.05)。2)随着SCFAs浓度的增加,CXC趋化因子配体3(CXCL3)、CXC趋化因子配体5(CXCL5)和CXC趋化因子配体8(CXCL8)的mRNA相对表达量逐渐下调,以SCFAs浓度为150 mmol/L时最低。SCFAs浓度为100 mmol/L时,GPR41的mRNA相对表达量显著高于SCFAs浓度为20和50 mmol/L时(P<0.05)。3) SCFAs浓度为150 mmol/L时紧密连接蛋白闭合蛋白-1(Claudin-1)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的mRNA相对表达量最低,且显著低于SCFAs浓度为20和50 mmol/L时(P<0.05)。4)相关性分析表明,GPR41的mRNA相对表达量与促炎症因子TNF-α的mRNA相对表达量呈显著正相关(P <0.05),与趋化因子CXCL3、CXCL5和CXCL8的mRNA相对表达量呈显著负相关(P<0.05),与紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的mRNA相对表达量呈负相关趋势(0.05≤P<0.10)。综上所述,高浓度(100和150 mmol/L)SCFAs诱导BRECs的促炎症反应,抑制趋化因子表达和免疫反应,减少紧密连接蛋白的表达,破坏瘤胃上皮的屏障功能。

溶血磷脂酰胆碱G-蛋白偶联受体G2A的研究

溶血磷脂酰胆碱(LPC)高亲和G-蛋白偶联受体G2A(GPCR G2A)是最大的细胞膜受体家族成员之一,具有七螺旋跨膜肽段结构。近年发现GPCR G2A与动脉粥样硬化和红斑狼疮等免疫性疾病的发病密切相关。随着生物技术及分子生物学的发展,GPCR G2A的研究已取得了很大的进展。现就GPCR G2A结构、分布、生理功能和信号传导作一简述。

性别决定区Y框蛋白2、含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5在宫颈癌中的表达及与临床病理特征的关系分析

目的探讨性别决定区Y框蛋白2(Sox-2)、含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(Lgr5)在宫颈癌中的表达及与临床病理特征的关系。方法收集2016年3月至2017年9月郑州市妇幼保健收治的经病理检查证实的74例宫颈癌、39例宫颈上皮内瘤变及36例正常宫颈组织石蜡包埋标本,应用免疫组化S-P法检测上述组织标本Sox-2、Lgr5蛋白表达情况,并分析Sox-2、Lgr5蛋白表达与宫颈癌患者性别、体质量、病理类型、肿瘤分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移之间的关系。结果Sox-2、Lgr5蛋白在宫颈癌组织中阳性表达率分别为77.03%、79.73%,均高于宫颈上皮内瘤变组织(38.46%、41.03%)和正常宫颈组织(5.56%、2.78%),差异均有统计学意义(P均<0.05)。Sox-2、Lgr5蛋白在宫颈癌组织中阳性表达率与患者性别、体质量、病理类型均无关(P均>0.05);Sox-2、Lgr5蛋白在宫颈癌组织中阳性表达率与患者的肿瘤分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关,肿瘤分化程度为低分化、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、肿瘤浸润深度为T3~T4、有淋巴结转移患者Sox-2、Lgr5蛋白在宫颈癌组织中阳性表达率高于肿瘤分化程度为高中分化、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤浸润深度为T1~T2及无淋巴结转移患者(P均<0.05)。结论Sox-2、Lgr5在宫颈癌中均呈高表达,且表达水平与患者疾病进展有着密切关系。

G-蛋白偶联受体在酵母中的表达及应用

综述了在不同酵母系统表达GPCR的研究进展

哈斯矩阵图的G-蛋白偶联受体类型预测

利用氨基酸数字编码模型,将蛋白质序列转换为数字序列,根据偏序理论构建蛋白质哈斯矩阵。基于同一类型蛋白质哈斯矩阵图具有相似图像纹理的假设,运用图像处理方法提取图像的几何矩作为伪氨基酸成分,对G-蛋白偶联受体类型分为2层进行预测,预测成功率分别为92.33%和85.48%。预测效果表明该方法是可行的。

G-蛋白偶联受体和神经再生

神经再生持续于哺乳动物整个成年期。成年神经再生受多种因素调节,包括神经营养因子、应激、炎性细胞因子以及G-蛋白偶联受体等。大量研究认为,神经再生障碍是抑郁症的发病机制。本文将围绕G-蛋白偶联受体将调控神经再生机制的研究进展进行综述,为以提高神经再生为靶点的抗抑郁药的研发奠定基础。

G-蛋白偶联受体40激动剂和拮抗剂的研究进展

G-蛋白偶联受体40（G-protein coupled receptor 40,GPR40）,即游离脂肪酸受体1（free fatty acid receptor 1,FFAR1）,是近年发现的体内饱和或不饱和中长链脂肪酸的天然受体,其主要表达于胰腺β细胞,并介导葡萄糖依赖的胰岛素分泌。糖尿病的发病机制未明,GPR40有望成为糖尿病治疗的新靶点,因其激动剂和拮抗剂不仅是进一步探索GPR40生物学功能的利器,而且为抗糖尿病药物发展开辟新途径。本研究就GPR40及其激动剂、拮抗剂与糖尿病关系的研究进展予以介绍。

甲状腺乳头状癌组织中G-蛋白偶联受体5和组织蛋白酶D的表达及临床意义

目的分析甲状腺乳头状癌组织与癌旁组织中G-蛋白偶联受体5(LGR5)及组织蛋白酶D(Cath D)的表达与各临床病理因素之间的关系。方法采用免疫组化的方法检测LGR5和Cath D在67例甲状腺乳头状癌与癌旁正常甲状腺组织中的表达,分析它们的表达与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结阳性、局部包膜侵犯、原发肿瘤区域淋巴结远处转移(TNM)分期等临床病理因素的关系。结果甲状腺乳头状癌和癌旁正常甲状腺组织中LGR5的阳性表达率分别为62. 69%(42/67)、2. 99%(2/67),Cath D的阳性表达率分别为70. 15%(47/67)、4. 48%(3/67),甲状腺乳头状癌组织中LGR5和Cath D阳性表达率均明显高于癌旁正常组织(P <0. 05)。在有淋巴结转移和局部包膜侵犯组织中,LGR5、Cath D阳性表达率明显高于无淋巴结转移者和无局部侵犯者(P <0. 05);不同肿瘤大小、不同TNM分期的病人甲状腺乳头状癌组织中LGR5及Cath D的阳性表达率均差异有统计学意义(P <0. 05); LGR5及Cath D的阳性表达率与病人年龄、性别无关(P> 0. 05)。结论甲状腺乳头状癌组织中LGR5和Cath D的高表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关。

G-蛋白偶联受体119激动剂的设计与合成

目的对G-蛋白偶联受体119激动剂的合成工艺进行改进。方法起始原料为:4-氰基哌啶-1-甲酸叔丁酯,反应步骤:硫代、缩合、醚化、脱Boc保护基、取代,最终得到G-蛋白偶联受体119激动剂MBX-2982。结果经上述5个反应步骤最终得到了G-蛋白偶联受体119激动剂MBX-2982,并且经1H-NMR和MS谱对结构进行了证实。结论本次试验对多个反应步骤进行了优化,使收率得到了提高,值得关注。

金茵利胆灵对豚鼠胆石症及G蛋白偶联胆汁酸受体表达的影响

目的研究金茵利胆灵对豚鼠胆囊容积和成石率与G蛋白偶联胆汁酸受体表达的影响。方法取雌性豚鼠72只,随机分为6组,每组12只,除正常对照组外其余5组给予盐酸林可霉素皮下注射建立胆石症模型。治疗组分为4组给予阿司匹林,金茵利胆灵高、中、低剂量药液灌喂,末次给药后1 h,切除胆囊测量胆囊容积,计算每组动物的胆囊内成石率。将胆囊组织进行HE染色后行显微镜观察,并行免疫组化观察阳性细胞。多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较用LSD-t法;计数资料采用χ2检验,两组间比较调整检验水准进行比较;等级资料采用Kruskal-Wallis H检验。结果模型组成石率高于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.00);金茵利胆灵高剂量组成石率较其他组降低。模型组胆囊大量中性粒细胞浸润,炎性改变明显;各药物治疗组中金茵高剂量组炎性改变最轻。模型组胆囊容积增加明显,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),造模效果较好;金茵利胆灵高剂量组胆囊容积相对最小,金茵利胆灵中剂量组和阿司匹林组胆囊容积相对略小,与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组胆囊黏膜TGR5阳性表达强,与正常对照组相比差异有统计学意义(P=0.00);金茵利胆灵高剂量组黏膜TGR5阳性表达较弱,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TGR5在胆石症豚鼠胆囊黏膜的表达显著增强。金茵利胆灵可以降低胆石症豚鼠胆囊黏膜TGR5阳性表达率,可减轻胆囊炎症,减少胆石形成。

环维黄杨星D对去甲肾上腺素诱导心肌细胞G蛋白偶联受体激酶-2表达的影响

目的观察环维黄杨星D(CVB-D)对去甲肾上腺素(NE)诱导心肌细胞损伤的保护作用及对G蛋白偶联受体激酶-2(GRK-2)表达的影响。方法体外培养新生SD大鼠原代心肌细胞,建立NE诱导的心肌细胞损伤模型,以细胞存活率,培养上清液乳酸脱氢酶的(LDH)活性反映心肌细胞损伤。酶联免疫吸附法(ELISA)测定环磷酸腺苷(cAMP)含量,Western blot分析G蛋白偶联受体激酶-2(GRK-2)蛋白表达。结果 NE能降低细胞存活率,提高培养液LDH活性,降低细胞内cAMP含量,增加GRK-2蛋白表达。CVB-D对NE诱导上述指标异常具有明显的改善作用。

G蛋白偶联受体30在宫颈癌组织中的表达及临床意义

目的分析G蛋白偶联受体30(GPR30)在宫颈癌组织中表达的临床意义。方法选取2012年9月—2015年6月收集的68例宫颈病变组织标本,其中宫颈癌组38例,宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组30例,另选择来院行妇科检查的20例正常宫颈组织作为对照组,观察3组宫颈组织CPR30的表达水平,并分析其与宫颈癌临床病理参数的关系。结果宫颈癌组和CIN组宫颈组织GRP30表达阳性率和GRP30 mRNA相对表达量均高于对照组,且宫颈癌组高于CIN组(P<0.05);不同分化程度、不同临床分期宫颈癌组织GPR30阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPR30参与宫颈癌的发生及进展,且与肿瘤分化程度、临床分期密切相关。

隐丹参酮通过G蛋白偶联受体55调节Wnt/β-catenin信号通路抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及其作用机制研究

目的探讨隐丹参酮对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法实验设置不同浓度隐丹参酮(CT)组、空白对照(NC)组、pcDNA-con组、pcDNA-GPR55组、CT+si-con组、CT+si-GPR55组。MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡;qRT-PCR检测GPR55 mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测蛋白表达。结果 MTT法检测显示,0 CT组、2CT组、4 CT组、8 CT组、16 CT组、32 CT组细胞增殖抑制率分别为(0.00±0.02)%、(25.04±2.50)%、(68.56±5.86)%、(85.44±8.54)%、(88.25±8.82)%、(80.11±8.01)%,与不含隐丹参酮的细胞相比,不同浓度隐丹参酮处理组TSCC细胞的增殖抑制率均显著升高(F=284.028,P<0.05)。隐丹参酮可抑制舌鳞状癌细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制Bcl-2、β-catenin表达,促进Bax、GPR55表达。过表达GPR55也抑制舌鳞状癌细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制CyclinD1、Bcl-2表达,促进Bax表达。低表达GPR55逆转了隐丹参酮对舌鳞状癌细胞的增殖抑制、凋亡促进及对β-catenin表达的抑制作用。与NC组(0.75±0.08)相比,CT组TSCC细胞中β-catenin表达水平(0.26±0.03)显著降低;与CT+si-con组(0.30±0.03)相比,CT+si-GPR55组TSCC细胞中β-catenin表达水平(0.62±0.06)显著升高(F=176.212,P<0.05)。结论隐丹参酮可抑制舌鳞状癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与调控GPR55及Wnt/β-catenin信号通路有关。

G蛋白偶联受体寡聚体的研究方法

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)能以同源或异源二聚体,甚至是高阶寡聚体的形式存在,这些形式有不同于单体的特异功能特征,例如生物合成、配体连接、脱敏、内化和降解,因此成为备受关注的药物设计靶点。而对GPCRs这些寡聚体形式进行药物设计首要的任务是要确定这些受体之间能否形成寡聚体。因此,本文将全面介绍用于研究GPCRs寡聚化的生物化学和生物物理方法。