G-CSF受体胞内区结合蛋白COXⅡ的分子克隆及相互作用验证

为寻找与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白,探讨其可能的信号传导机制,应用酵母双杂交技术从小鼠胎肝文库中筛选到与G-CSF受体胞内区相互作用的蛋白—细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基(COXⅡ);采用PCR技术从小鼠肌肉cDNA中克隆到全长COXⅡ,并应用哺乳动物细胞双杂交实验验证了COXⅡ与G-CSF受体胞内区相互作用;构建了一系列G-CSF受体胞内区短截体,应用细胞双杂交技术确定COXⅡ主要结合于G-CSF受体的Box3区;随后构建了COX Ⅱ-GFP融合表达载体,观察到COXⅡ在COS_7细胞中为全细胞分布。这些结果为揭示COXⅡ的新功能及发现G-CSFR新的信号传递通路提供了线索。

G-CSF受体胞内区与AK017149的相互作用

为研究G CSF受体胞内区与AK017149基因之间的相互作用,进而揭示G CSF受体信号转导通路的可能机制,采用高敏感性的酵母双杂交体系,筛选小鼠胎肝文库,在筛选过程中获得了1个功能未知的基因片段 AK017149,并在酵母和哺乳动物细胞体内验证了该基因片段的表达蛋白与G CSF受体间的相互作用.实验研究提示,G CSF受体作为胞内信号转导的起始点,可以与众多蛋白因子相结合,对其中未知蛋白的研究,可以为揭示G CSF受体信号转导通路起重要的提示作用.

白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响

观察白血病抑制因子 (LIF)受体gp190亚基完整的细胞内区和gp190胞内区C末端片段(190CT)对人白血病系HL 6 0表达CD14、CD15的影响 ,进一步了解LIF引发白血病细胞增殖抑制和分化的关系 .用基因重组技术将LIF另一亚基gp130的细胞内区换成gp190的细胞内区 ,用PCR技术扩增gp190细胞内区C末端的一个多肽的编码序列 ,构成嵌合体受体基因 130 /190及 190CT片段 ,并分别在HL 6 0细胞表达 .用免疫组化和流式细胞术检测分析在LIF的诱导下 ,HL 6 0细胞表达CD14、CD15的水平 .转染pcDNA130 /190的HL 6 0细胞 ,CD15表达量明显增高 ;转染pcDNA190CT的细胞 ,CD15的表达量降低 ;但 2组细胞的CD14表达量均较低且水平接近 .LIF可能诱导HL 6 0细胞向粒细胞而不向单核细胞分化 ,该效应是由gp190亚基细胞内区介导的 ,而gp190C末端片段可干扰LIFα受体介导的信号传导效应 .

LIF受体a亚基胞内区远膜端对HL-60细胞增殖分化的影响

目的：探讨LIF受体a亚基胞内区远膜端对HL-150细胞增殖分化的影响。方法：构建LIF受体a亚基胞内区远膜端(gp190CT3)真核表达载体，利用脂质体转染HL-60细胞，G418筛选阳性细胞株，免疫组化检测其表达。倒置显微镜观察野生型HL-60细胞及转染有gp190CT3的HL-60细胞及转染有空载体的HL-60细胞的生长状态。

白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区

本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系。采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能。结果表明,序列分析显示载体构建正确;包装病毒对K562细胞感染效率40%-70%,流式分选获得稳定表达细胞株;RT-PCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达;Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达;胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高。结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础。

成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用

目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。

抗KDR胞内区(KDR-CD)单克隆抗体的制备和鉴定

目的:研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区(KDR-CD)的特异性单克隆抗体(mAb)。方法:以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞;用间接ELISA法测定其亲和力、亚类,Western blot检测其特异性。结果:获得1株稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株,命名为2B8H2A5;它分泌的抗体亚类为IgG1,к型轻链,而且亲和力强、特异性高。结论:成功获得能分泌抗KDR-CD mAb杂交瘤细胞,为以后将该mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂,使其能进入细胞内与受体KDR-CD特异性结合并阻断血管内皮细胞生长因子强大的生物学功能奠定了重要的基础。

神经营养因子受体Trk和p75NTR的信号传递途径

神经营养因子是一类对特定类型的中枢和外周神经系统神经元的生存和发展至关重要的生长因子家族。

白血病抑制因子受体α亚基胞内区远膜端对HL-60细胞增殖分化的影响

目的 探讨白血病抑制因子 (LIF)受体α亚基胞内区远膜端对HL 60细胞增殖分化的影响。方法 构建LIF受体α亚基胞内区远膜端 (gp190CT3 )真核表达载体 ,利用脂质体转染HL 60细胞 ,G418筛选阳性细胞株 ,免疫组化检测其表达。倒置显微镜观察野生型HL 60细胞及转染有gp190CT3的HL 60细胞的生长状态。以Westernblot及流式细胞仪分别检测野生型HL 60细胞及转染有gp190CT3的HL 60细胞中细胞增殖核抗原 (PCNA)及CD15水平。 结果 转染有gp190CT3的HL 60细胞体积增大 ,与野生型HL 60细胞相比 ,转染有gp190CT3的HL 60细胞增殖速度减慢 ,PC NA的表达水平明显降低 ,而CD15水平明显升高 (转染有gp190CT3的HL 60细胞中CD15阳性细胞百分率为 89.98% ,野生型HL 60对照组中CD15阳性细胞百分率为 40 .79% )。结论 LIF受体α亚基胞内区远膜端参与LIF受体的信号转导 ,其效应是抑制细胞的增殖 ,促进细胞分化。

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。

胞内区功能缺失的EGFR基因对胚胎生殖细胞系EG4分化的影响

ＥＧ４细胞是由 １０．５ ｄ胎龄的 １２９／ｓｖＪ 小鼠原始生殖细胞经体外培养得到的多能干细胞系． ＥＧ４细胞的发育多能性使其可作为研究细胞分化的体外模型．通过基因转染的方法获得能表达胞内区缺失的外源ＥＧＦＲｄ基因的ＥＧ４细胞，定名为ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ．分析其生长分化特性，发现：（ｌ）ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ细胞可在未分化状态下维持长时间的增殖；（２）经维生素Ａ酸（ＲＡ）诱导后，作为对照组的大部分ＥＧ４细胞和转染空白质粒的细胞分化为脂肪细胞，而ＥＧ４－ＥＧＦＲｄ细胞的分化趋势不明显，表明ＥＧＦＲ在脂肪细胞的发育分化中具有一定的调节作用；（３）ＥＧ４细胞接种小鼠皮下，长出的肿块切片分析显示，突变型肿块组织含有大量的未分化细胞和结缔组织，分化细胞以骨骼肌为主，对照组主要含软骨细胞、角质和上皮细胞以及神经管等分化组织．结果表明，ＥＧ４细胞的ＥＧＦＲ信号传导系统受抑制后，阻碍了依赖ＥＧＦＲ的细胞分化．

HER3与肿瘤及肿瘤耐药的关系研究进展

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）家族属于受体酪氨酸激酶,包括4种I型跨膜受体：EGFR（HER1）、HER2（Neu,ERBB2）、HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）。这些受体均包含细胞外区、跨膜区和胞内区3个部分,其中细胞外区包含4个结构域,胞内区包含1个用来信号传导的细胞内酪氨酸激酶结构域和1个位于胞浆内的带有酪氨酸磷酸化残基的尾部。

靶向性表皮生长因子受体siRNA表达载体的构建和表达

目的 构建靶向性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的小分子干扰RNA(sm all interfering RNA,si RNA)表达载体并在TJ90 5人脑恶性胶质瘤细胞系表达。方法 在人EGFR细胞外区受体结合结构域和细胞内区酪氨酸激酶结构域各选择1个si RNA靶序列、进行了psi RNA- Neo G2表达载体的构建,进而以反义EGFR表达载体p- anti- h EGFR为对照进行了脂质体介导的TJ90 5人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用免疫荧光和蛋白印迹检测EGFR的表达。结果 成功构建以psi RNA- Neo G2为载体的si RNA表达质粒,并分别使其在稳定转染TJ90 5细胞后EGFR表达下调90 %和92 % ;反义EGFR表达载体p- anti- h EGFR使EGFR表达下调82 %。结论 靶向EGFR的si RNA表达载体可以特异性地抑制EGFR的表达,可以成为胶质瘤靶向性EGFR基因治疗的一种新策略。