人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5',3'端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN、构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两欹包装，病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10^6CFU／m1)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后．分泌G-CSF达168U／m1．Southern分析表明hG-CSF基因己整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中，Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在ENIH3T3-G-CSF细胞的表达。NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内．能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。

成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法促进化疗后造血功能恢复的实验研究

本实验观察了成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法对大剂量化疗后造血功能损伤小鼠的恢复作用。结果发现:接受G-CSF基因治疗的实验小鼠外周血白细胞尤其是中性粒细胞降低程度明显减弱,恢复速度明显加快;并可明显促进血小板的恢复,但作用较缓;其脾脏和骨髓CFU-GM、CFU-MK、CFU-S水平显著地高于对照组,表明成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法可显著降低大剂量化疗后造血损伤程度,并明显加速受损的造血功能的恢复。

利用PCR方法从人染色体DNA中扩增G-CSF基因的研究

以正常中国人脐带血提取的基因组ＤＮＡ为模板，采用ＰＣＲ方法扩增人Ｇ－ＣＳＦ基因组基因．通过优化和筛选扩增条件，使用不同的ＤＮＡ聚合酶，采用碱变性模板和热启动等方法，成功地获得了１．５ｋｂ的Ｇ－ＣＳＦ基因．

人G-CSF基因组基因的克隆和序列测定

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种定向作用于粒系祖细胞的造血生长因子,它能特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖、分化、存活和活化,对治疗各种原因引起的粒细胞减少症具有显著疗效。许多研究者对G-CSF cDNA在大肠杆菌和其它表达系统中进行了研究,但应用G-CSF基因组基因所做的有关表达方面的研究为数不多。本研究利用PCR技术。

转基因小鼠乳腺表达G-CSF的研究

用PCR法从正常中国人脐带血提取总DNA作为模板,扩增出1.5 kb的人G-CSF基因组基因。序列分析证实其正确性。将其插入小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的起始密码子ATG前的KpnⅠ位点,使其受控于2.6kb的WAP调控序列,构建成乳腺表达载体pWGG。回收经EcoRⅠ酶切后的8.7kb片段用于显微注射。共注射1200枚受精卵,移植34受体母鼠,产仔鼠85只。经PCR检测和DNA印迹分析,证实获得两只整合有人G-CSF基因的雄性鼠,整合率为2.37％。建立的转基因鼠系表明,采用ELASA方法对F1代雌鼠乳汁检测,成功地表达出人G-CSF。表达量为120～250ng/ml。这一结果表明转基因的表达具有乳腺特异性。这为在大动物中实施转基因提供了依据。

Expression of Human GCSF in Mammary Gland of Mice by Injection of Plasmid DNA

The vectors carrying the genes coding for the proteins of interest are of unpredictable efficiency in transgenic animals. The expression vector of mammary gland (pINGG) containing GCSF genomic DNA was injected into mouse mammary gland, and expression was detected in the milk of mice. The result showed that mammary gland injection method could provide a convenient transient system to confirm vector validity.