牛流行热病毒糖蛋白G_1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。

牛流行热病毒G_1抗原表位基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,与表达载体pGEX-4T-1连接,成功构建重组质粒pGEX-G1。重组质粒转化BL21(DE3),以IPTG进行诱导,并确定了最佳表达条件的IPTG浓度为0.1mmol/L、反应温度为16℃、诱导时间为18h。可溶性表达的目的蛋白经Glutathione Sepharose TM4B介质纯化,纯度达80%;以包涵体形式存在的重组蛋白以2%的脱氧胆酸钠洗涤、0.5%的N-十二烷基肌氨酸钠溶解、透析复性、Glutathione Sepharose TM4B纯化后,纯度达85%以上。Western blot试验表明纯化的目的蛋白有良好的反应原性。经间接ELISA检测,测得牛流行热病毒12份阳性血清的OD490值平均为1.813±0.231,12份阴性血清的OD490值平均为0.359±0.032,差异极显著(P<0.01)。将重组蛋白作为抗原免疫兔子,试验兔均产生了高滴度的抗体,证实该蛋白有免疫原性。将目的蛋白作为包被抗原,测得8份狂犬病病毒阳性血清的OD490值平均为0.324±0.031,与所测12份阴性血清的OD490值接近,说明不存在交叉反应。以上结果均证实纯化后的重组蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA试剂盒。