HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。

类风湿性关节炎病人关节滑膜液与外周血中G1特异性T细胞的特点

目的为比较研究类风湿性关节炎病人 T细胞库中是否存在 G1特异性 T淋巴细胞极其生物学特性。方法应用重组人软骨抗原凝集原 G1为抗原 (r G1) ,采用国际标准半有限稀释建立细胞株法 ,从类风湿性关节炎病人外周血中分离建立 G1特异性 T细胞并分析其生物学特性。结果从 4名类风湿性关节炎病人外周血中分别分离建立了 13株 G1特异性 T细胞株。分析比较了这些细胞株 ,发现病人的 G1特异性 T淋巴细胞出现频率为 36 .2 %。所有 T细胞株与 r G1及 WT和 PPD共同培养以观察其特异性反应性 ,结果发现所建立的 13株 T细胞株对人软骨抗原凝集素 G1区具有良好的特异性。进一步用r G1肽段分析 ,发现其中 5株主要对 G1C末端呈特异性反应。细胞表型分析发现 ,所有这些 T细胞株均表现为 CD3+、CD4+与αβ TCR阳性 ;细胞因子分泌类型以 TH1为主。结论 RA病人外周血与关节滑膜液中均有 G1特异性 T细胞。

人rG1特异反应性T细胞生物学特性的研究

目的分析重组人软骨抗原凝集原 (rG1 )体外诱导建立的 1 1株rG1特异性T细胞株的生物学特性。方法采用直接标记免疫荧光法对rG1特异性T细胞株进行表型分析 ;采用QuantikineELISAKits定量检测细胞培养上清液中的IFN -γ与IL - 4;采用RT -PCR方法分析其BV的限制性取用。 结果所建细胞株均表现为CD3阳性 (98.6 %± 1 .5 % ) ,大部分细胞株 (9/ 1 1 )为CD4阳性 (97.1 %± 2 .5 % ) ,而其余 2株为CD4和CD8混合表达 ,其中CD4阳性为 82 .95 % ,CD8阳性为 36 .5 0 %。 8株分泌IFN -γ(5 44± 390 pg/ml) ,而IL - 4阴性 ,为Thl细胞 ;1株同时分泌IFN -γ和IL - 4,为Th0细胞 ;2株细胞未测出IFN -γ和IL - 4分泌 ;无Th2细胞株出现。所有T细胞株均选择性取用αβ(97.4%± 2 .4% )TCR受体。 结论所建立的rG1特异性T细胞株经表面鉴定为纯度很高的CD3阳性T细胞 ,多表现为CD4阳性 ,细胞因子分泌类型多属Th1T细胞。

has-miR-497-5p靶向CCNE1对类风湿性关节炎滑膜细胞增殖的影响

目的 评价has-miR-497-5p对类风湿性关节炎滑膜细胞(HFLS-RA)增殖的影响。方法 利用miRDB、TargetMiner、TargetScan和miRTarBase数据库预测has-miR-497-5p的作用靶基因,然后利用DAVID数据库对靶基因进行GO分析和KEGG信号通路富集,String数据库对靶基因进行互作分析;以HFLS-RA为研究对象,MTT检测has-miR-497-5p对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测has-miR-497-5p对细胞周期的影响;利用qRT-PCR检测has-miR-497-5p对HFLS-RA细胞CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6 mRNA的影响;MTT评价has-miR-497-5p在沉默CCNE1后对细胞增殖的影响。结果 生物信息学预测has-miR-497-5p的靶基因共计125个,生物学过程主要集中于胸腺发育、蛋白质磷酸化、细胞凋亡和细胞周期等方面;信号途径主要富集于癌症相关的microRNA、PI3K-Akt途径和细胞周期等;细胞周期中的富集蛋白互作分析显示,CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6之间存在相互作用;has-miR-497-5p过表达可以显著抑制细胞增殖(P<0.05),明显抑制细胞周期的S期(P<0.05);qRT-PCR结果显示,has-miR-497-5p模拟剂可以显著降低CCNE1、CCND1、CCND2和CDK6 mRNA表达(P<0.05);沉默CCNE1显著抑制细胞增殖(P<0.05)。结论 has-miR-497-5p可能通过靶向CCNE1抑制HFLS-RA增殖。

微小RNA-483-3p靶向G1S特异性细胞周期蛋白E1对结肠癌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-483-3p靶向G1S特异性细胞周期蛋白E1(CCNE1)对结肠癌细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法选取我院收集的结肠癌和癌旁组织样本作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析肿瘤组织和癌旁组织miR-483-3p表达;在结肠癌细胞株中采用慢病毒建立对照miRNA和miR-483-3p过表达细胞株(miR-control组和miR-483-3p组),采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖能力,采用Tranwell分析两组细胞的迁移能力;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-483-3p靶基因,并分析靶基因对结肠癌细胞增殖和迁移的影响。采用t检验分析两组间差异。结果与结肠癌癌旁组织miR-483-3p(1.12±0.21)比较,结肠癌组织中miR-483-3p表达水平(0.37±0.12)显著下调,差异有统计学意义(t=3.001,P<0.000)。与miR-control组细胞比较,miR-483-3p组细胞增殖显著下降,差异有统计学意义(F=2.891,P<0.05)。与miR-control组细胞(86.32±9.32)%比较,miR-483-3p组细胞划痕愈合率(32.65±6.18)%显著下降,差异有统计学意义(t=4.011,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶基因证实CCNE1是miR-483-3p的靶基因。在miR-control组中,过表达CCNE1蛋白后细胞增殖能力明显高于过表达空载体的细胞,差异有统计学意义(F=3.193,P<0.05),而在miR-483-3p组细胞中过表达CCNE1蛋白后细胞增殖能力较过表达空载体的细胞,差异无统计学意义(F=0.132,P>0.05)。结论miR-483-3p在结肠癌中表达水平显著下调,导致其靶基因CCNE1表达水平增加,促进了结肠癌的增殖和迁移。

从健康人外周血建立人软骨抗原凝集原G1区自身反应性T淋巴细胞株

为了研究健康人T细胞库中是否存在G1特异性T细胞 ,我们应用重组人软骨抗原凝集原G1为抗原 (rG1) ,采用国际标准半有限稀释建系法 ,从 4名正常人外周血中建立了 11株rG1特异性T细胞系。 4名健康供者的rG1特异性T细胞系出现频率分别为 0 6 / 10 6(RP )、 0 5 / 10 6(AC )、 1 6 / 10 6(YZ )和 2 0 / 10 6(JY ) ,平均为 1 1± 0 5 / 10 6。远远低于类风湿性关节炎病人外周血rG1特异性自身反应性T细胞。所有T细胞系与rG1及WT和PPD共同培养以观察其特异性反应性 ,结果发现所建立的 11株T细胞系对人软骨抗原凝集素G1区具有良好的特异性。本研究结果提示正常人外周血中确有rG1特异性T细胞系 ,但是出现频率远远低于类风湿性关节炎病人 (另文报道 )。