汉滩病毒Z10株G1糖蛋白编码区克隆及序列分析

目的 汉滩病毒浙 10 (Z10 )株G1糖蛋白编码区的克隆、核苷酸序列分析 ,提供我国应用最为广泛的肾综合征出血热 (HFRS)疫苗株序列资料。方法 反转录PCR法扩增G1基因片段 ,克隆入pGEM T载体 ,双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 测定 144 9个核苷酸 ,可编码 483个氨基酸。与Ⅰ型 76 118、Lee、Hojo株比较核苷酸同源性分别为 87%、86 %、86 % ,与Ⅱ型R2 2株同源性为6 7%。比较氨基酸序列Z10株与Ⅰ型、Ⅱ型病毒的同源性分别为 (94～ 95 ) % ,(77～ 80 ) %。Z10与 76 118G1编码的氨基酸变异多发生于N′端 ,最大的变异区是第 84～ 93位氨基酸的 10个连续变异。结论Z10株病毒和其它汉滩病毒在核苷酸序列虽有较大差异 ,但在氨基酸水平上的同源性仍较高 ,可能是Z10株沙鼠肾疫苗具有较好免疫保护作用的原因。

汉坦病毒G1糖蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白的毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码G1包膜糖蛋白的基因,将扩增产物分别与pMD18-T simple载体连接,经序列分析后双酶切,定向克隆入载体pPICZαA,继而用BstX I酶切线性化重组质粒并电转化入P.pastoris X33感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果 PCR扩增产物Z10株为1 937bp、L99株为1 991bp,与T载体相连测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.5%和99.7%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆毕赤酵母表达载体获得pPICZαA-Z10G1和pPICZαA-L99G1,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10G1和PpX33-L99G1,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。

汉滩病毒核蛋白部分片段与囊膜糖蛋白G1在昆虫细胞中的融合表达

目的 应用Bac -to -Bac杆状病毒表达系统融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白部分片段。方法 构建含有汉滩病毒G1S0 7嵌合基因的杆状病毒表达载体 pFBD -G1S0 7,转化DH10Bac致敏菌 ,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上 ,快速筛选出含有G1S0 7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白 ,利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果 构建的含G1S0 7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,表达产物主要集中在细胞内。结论 在昆虫细胞中表达出具有生物学活性的G1S0 7融合蛋白 。

肾综合征出血热汉坦病毒编码G1和G2糖蛋白核苷酸序列的分析

目的：了解青岛市流行性出血热患者中感染的汉坦病毒类型和遗传进化特点.方法：免疫胶体金法检测门诊或住院流行性出血热患者中汉坦病毒IgM、IgG抗体.编码病毒G1和G2糖蛋白基因的扩增是通过RT-PCR方法,并经测序获得序列.应用DNAStar软件分析G1和G2糖蛋白基因的核苷酸序列相似性、 序列差异性和构建系统进化树.结果：对126例肾综合征出血热的临床病人检测,其中112份血清呈现IgM和/或IgG抗体阳性.共获得10株汉坦病毒编码G1和G2糖蛋白基因序列,其相互间核苷酸相似性达到71~99.8%.与汉滩型和汉城型序列比较构建系统发生树,结果显示有两个分支,其中4株与汉滩型亲缘近,而另外6株与汉城型在一个分支.结论：引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒为汉滩型和汉城型的混合感染.

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1人源IL2融合基因疫苗(pcDNA3.1/HisB IL2G1)的免疫效应。方法将pcDNA3.1/HisB IL2G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;酶联免疫法(ELISA)检测抗汉坦病毒(HTNV)抗体;空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价;淋巴细胞增殖试验(MTT法)检测免疫小鼠的细胞免疫反应;动物保护试验以BALB/c小鼠为感染动物模型,在第3次免疫后2周,腹腔内注射100TCID50(半数感染量)HTNV,然后以免疫荧光法观察鼠肾切片,评价其保护力。结果pcDNA3.1/HisB IL2G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体,中和效价为1∶20～1∶80。MTT法结果表明,免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3.1/HisB IL2G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3.1/HisB IL2G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3 1/His B IL 2 G1,为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法采用PCR从含有人源IL 2的质粒中扩增出IL 2片段 ,将人源IL 2插入真核表达载体pcDNA3 1/His B中 ,构建的质粒命名为pcDNA3 1/His B IL 2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H82 0 5株G1基因片段 ,将回收的G1片段经双酶切插入到pcD NA3 1/His B IL 2 ,构建成新的质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1。采用脂质体介导包裹 ,转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达 ;采用原位杂交观察细胞内的基因表达 ,SDS PAGE法作重组质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达一分子量为 78kD左右的蛋白 ,对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3 1/His B IL 2 G1融合基因 。

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达。从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle—G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western—blot进行鉴定。酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX—G1S0.7;ELISA检测结果和Western—blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合。说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据。

汉滩病毒G_1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。