结直肠癌患者循环肿瘤DNA定量KRAS基因突变的检测

目的建立结直肠癌KRAS基因G12D液体活检技术,并探讨其在结直肠癌诊疗中的应用价值。方法用微滴式数字PCR(ddPCR)技术定量检测52例结直肠癌患者和80名健康对照的血浆游离DNA的KRAS基因G12D突变率和突变浓度;以结直肠癌患者肿瘤组织KRAS基因测序结果为金标准评价ddPCR检测的准确性;分析结直肠癌患者KRAS基因G12D突变率、浓度与其临床表征的关系。结果结直肠癌患者血浆KRAS基因G12D突变型检出率(26.92%)和浓度中位数(81.5 copies/m L)显著高于健康对照(8.75%,16 copies/m L);结直肠患者组高分化腺癌的KRAS基因G12D突变浓度显著高于中分化和低分化腺癌(P<0.05),淋巴结转移N2的KRAS基因G12D突变浓度显著高于N0和N1(P<0.05);结直肠癌患者血浆KRAS基因G12D突变与肿瘤组织突变一致性达87.50%。结论ddPCR检测方法是一种快速、无创和准确的检测血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)的方法,其检测结果可为临床用药指导和病程监控提供依据。

K-Ras^(G12D)基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建K-RasG12D基因突变体慢病毒载体。方法:从病人组织中提取RNA通过RT-PCR反转录获得cDNA作为K-RasG12D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasG12D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果:所构建的K-RasG12D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论:成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。

突变KRAS的互作化学分子研究

利用互作蛋白质组化学技术发现G12D突变型KRAS相互作用化学分子。建立融合蛋白质表达量相同的BioID-G12D-KRAS与BioID-WTKRAS细胞,通过LC-MS/MS检测生物素化肽段,定量分析蛋白质组学数据,预测野生型KRAS和G12D突变型KRAS的潜在结合分子。最终成功培养BioID-G12D-KRAS和BioID-WT-KRAS表达含量相同的SW48细胞;定量质谱识别BioID-WT-KRAS组中有88个生物素化蛋白质,BioID-G12DKRAS组中有90个生物素化蛋白质;发现AHNAK2与野生型KRAS更稳定结合,SLC5A3与G12D突变型KRAS优势结合。