中国汉坦病毒H8205株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总 RNA,采用 RT- PCR和分子克隆技术将扩增到的 G2糖蛋白基因插入含 CMV启动子的 pc DNA3.1/ His质粒载体中 ,通过脂质体介导转染 COS- 7细胞 ,用 SDS- PAGE、 Western- blot及 IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的 G2 - pc DNA3.1/ His重组表达质粒 ,表达产物的相对分子量为 5 6 ku,与理论预期大小一致 ,并且可与汉坦病毒 H82 0 5株的腹水抗体起特异反应。表明构建的 G2 - pc DNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有 ,能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性 ,重组质粒可应用于汉坦病毒的

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体,为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因,经相应限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1/His,并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞,用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果获得正向插入的pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒,表达产物的相对分子量为105 kD,与理论预期大小一致,并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3.1/His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。

肾综合征出血热汉坦病毒编码G1和G2糖蛋白核苷酸序列的分析

目的：了解青岛市流行性出血热患者中感染的汉坦病毒类型和遗传进化特点.方法：免疫胶体金法检测门诊或住院流行性出血热患者中汉坦病毒IgM、IgG抗体.编码病毒G1和G2糖蛋白基因的扩增是通过RT-PCR方法,并经测序获得序列.应用DNAStar软件分析G1和G2糖蛋白基因的核苷酸序列相似性、 序列差异性和构建系统进化树.结果：对126例肾综合征出血热的临床病人检测,其中112份血清呈现IgM和/或IgG抗体阳性.共获得10株汉坦病毒编码G1和G2糖蛋白基因序列,其相互间核苷酸相似性达到71~99.8%.与汉滩型和汉城型序列比较构建系统发生树,结果显示有两个分支,其中4株与汉滩型亲缘近,而另外6株与汉城型在一个分支.结论：引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒为汉滩型和汉城型的混合感染.

汉坦病毒L99株G_2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒的Vero-E6细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含有CMV启动子的真核表达质粒pVAX1。通过脂质体介导转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法检测瞬时表达的蛋白。结果获得含有编码汉坦病毒L99株包膜糖蛋白G2基因的重组质粒pVAX/G2。在转染cos-7细胞内,用IFA可检测到细胞内有特异性荧光。证实成功构建了汉坦病毒L99株包膜糖蛋白G2基因真核表达载体,并可在cos-7细胞中瞬时表达;为出血热综合征疫苗制备奠定了基础。

汉滩病毒糖蛋白G2酵母双杂交诱饵载体的构建及初步鉴定

目的利用Ras募集系统(RRS),构建并鉴定含汉滩病毒囊膜糖蛋白G2的诱饵载体。方法将汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras-G2及Ras-G2’(G2’无前导肽序列)。将两个嵌合基因分别克隆入酵母表达载体pMet25,并转化至酵母温度敏感株cdc25-2,检测其对RRS系统的激活作用。结果限制性内切酶酶切鉴定表明,Met-G2和Met-G2’载体构建正确。激活试验结果为阴性。结论Met-G2和Met-G2’载体可用于从cDNA文库中筛选汉滩病毒受体。

汉滩病毒囊膜糖蛋白G_2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 。

体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用

根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。

汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的表达及相互作用

目的研究汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2与β3整合素之间的相互作用。方法根据HV76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR和基因重组获得带有EGFP标签的G2和带有FLAG标签的β3整合素膜外区片段融合表达质粒,并且在HEK293细胞中进行表达。将表达成功的G2与β3整合素片段进行免疫共沉淀,用Western blot检测它们之间的相互作用。结果成功构建了G2和β3整合素膜外区各片段的融合表达质粒。将各表达质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,Western blot结果显示β3整合素膜外区各功能片段在细胞裂解上清中获得大量表达,而G2蛋白膜外区仅有81-140片段在细胞裂解上清中大量表达。将G2 81-140片段与β3整合素膜外区各功能片段进行免疫共沉淀的结果显示,仅G2 81-140片段和β3整合素27-133片段在细胞中以复合物存在,提示两者之间可能有直接的相互作用。结论汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2 81-140片段与β3整合素27-133片段在细胞中以复合物的形式存在,两者之间存在着相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒受体提供了进一步的证据。

HSV-2型糖蛋白G基因免疫优势表位片段的克隆和表达

目的:通过基因工程技术,克隆和表达单纯疱疹病毒2型糖蛋白G(HSV-2 gG)基因的免疫优势表位片段。方法:用PCR技术扩增HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果:PCR法扩增出1 242 bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论:HSV-2 gG基因的免疫优势表位片段的成功表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础。

汉坦病毒DNA疫苗pVAX/G2诱导小鼠的免疫应答

目的探讨含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答。方法重组质粒pVAX/G2转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法(IFA)检测瞬时表达产物。经碱裂解法提取质粒pVAX/G2,Sepharose CL-4B柱层析纯化后,免疫BALB/c小鼠(SPF),并采用含有人IL-2基因的重组质粒pVAX/IL-2及重组人IL-2蛋白作为DNA疫苗的佐剂,检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。结果重组质粒pVAX/G2能够在真核细胞中表达。免疫小鼠血清中能够检测到抗汉坦病毒中和抗体、酶标抗体和荧光抗体。淋转刺激指数和脾淋巴细胞上清液中IL-2活性,与空载体pVAX1阴性对照比较差异有显著意义。质粒佐剂pVAX/IL-2能显著提高DNA疫苗的细胞免疫水平。结论含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定强度的体液免疫和细胞免疫应答。

汉滩病毒G_2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。

抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原及D-二聚体的变化对妊娠期静脉血栓的指导作用

目的抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原、D-二聚体是妊娠期凝血功能指标,本研究通过测定妊娠期静脉血栓患者以上指标表达水平,为妊娠期静脉血栓的预防、治疗、诊断提供一定的理论依据。方法选择2018年2月—2019年12月河南省直属机关第二门诊部妊娠期静脉血栓患者60例作为研究对象,分为中孕组、晚孕组各30例,选择同期33例健康孕妇作为对照组。测定所有研究对象血中抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原、D-二聚体水平。结果中孕组和晚孕组的抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原、D-二聚体水平与对照组比较,均有明显升高(P<0.05),但中孕组和晚孕组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组孕妇血浆中抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原、D-二聚体无明显相关性(P>0.05),抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M,血小板聚集率,血浆纤维蛋白原,D-二聚体进入方程,为妊娠期静脉血栓密切相关的危险因素(P<0.05),且D-二聚体最为重要。结论妊娠期静脉血栓患者血浆中抗β2糖蛋白Ⅰ抗体IgA/G/M、血小板聚集率、血浆纤维蛋白原、D-二聚体浓度较对照组孕妇明显升高,提示以上指标与妊娠期静脉血栓形成有密切关系,与疾病的严重程度相关,血管内皮损伤在妊娠期静脉血栓中发挥着重要作用。

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。

一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选

目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白。将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照,通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白。结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81～140片段之间存在着特异性的相互作用。结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子。

汉坦病毒依赖RNA的RNA聚合酶研究进展

汉坦病毒（Hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属，是单链、分节段的负链RNA病毒，其基因组由大（Large，L）、中（Medium，M）、小（Small，S）3个片段组成。分别编码病毒依赖RNA的RNA聚合酶（L蛋白）、G1和G2糖蛋白、核衣壳蛋白（NP）。汉坦病毒由啮齿类动物携带，在宿主动物中产生非致病性持续性感染，可以经过啮齿类动物排放的病毒污染的气溶胶等多种途径感染人类。