贝类多糖对HepG2.2.15细胞JAK-STAT信号转导途径分子表达的影响

目的了解贝类多糖对Hep G2.2.15细胞JAK-STAT信号转导途径分子表达的影响。方法用RT-PCR的方法检测经贝类多糖处理的Hep G2.2.15细胞在不同时间段的STAT1和STAT2 m RNA表达的水平。结果 RT-PCR结果显示经贝类多糖处理后Hep G2.2.15细胞STAT1和STAT2 m RNA表达水平明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),表明Hep G2.2.15细胞对贝类多糖有应答。结论贝类多糖对HBV有一定的抑制作用,其作用机制可能与INF-α类似。

HepG2.2.15细胞的差异性表达及对IFN-α的反应性研究

采用有限稀释法从HepG2.2.15细胞株中分离出10株单克隆细胞株。ELISA法检测其HBsAg与HBe Ag表达量,根据HBsAg、HBe Ag表达量的不同,筛选出最高、中等、最低3株克隆细胞株。MTT法进行干扰素(IFN)-α的细胞毒作用研究,表明IFN-α对不同克隆细胞株药物毒作用相似。ELISA法检测各克隆细胞株给IFN-α前后HBsAg、HBe Ag表达量,IFN-α对HepG2.2.15细胞HBe Ag的抑制作用较弱,对HBsAg、HBV DNA的抑制作用较强,且对表达量高的克隆细胞株抑制作用更强。不同HepG2.2.15细胞表达HBsAg与HBe Ag存在差异性,且表达量高的细胞株对治疗浓度的IFN-α更加敏感。

阿德福韦酯持续干预对HepG2.2.15细胞经典耐药突变的诱导作用

目的观察Hep G2.2.15细胞在不同浓度阿德福韦酯(ADV)持续诱导下发生经典耐药突变的情况,并探讨其产生耐药的机制。方法用不含或含0.01、0.1、1.0μmol/L ADV的培养基于12孔板中培养Hep G2.2.15细胞,每3d传代,共培养至110代,分别抽提细胞和上清中的HBV DNA,每10代取样1次。以不降解质粒的ATP依赖性DNA酶消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法和单管巢式PCR方法分别扩增细胞内HBV ccc DNA和上清中HBV DNA的反转录酶(RT)区。以PCR产物直接测序结合克隆测序法(20个克隆/样本)分析细胞内HBV ccc DNA和上清HBV DNA的RT区是否产生经典ADV耐药突变。结果未经药物处理的对照组持续稳定表达HBV DNA。0.01μmol/L ADV组和0.1μmol/L ADV组随着ADV干预时间的延长,细胞内总HBV DNA、ccc DNA及上清中HBV DNA的载量持续下降。0.01μmol/L ADV组细胞内和上清中至110代仍未检测出耐药变异,0.1μmol/L ADV组细胞内和上清中在110代时检测到RT区发生rt A181V+N236T变异。1.0μmol/L ADV组由于细胞生长受到抑制于第15代时停止培养。结论 Hep G2.2.15细胞内存在HBV ccc DNA循环池,用含适量浓度ADV的培养基持续培养可以诱导Hep G2.2.15细胞发生经典耐药突变。

不同产地甘草对HepG2.2.15细胞表达乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原的影响

目的通过体外实验比较不同产地的甘草提取液对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用,为甘草药材的质量评价及抗病毒新药的研发提供科学依据。方法体外培养人肝癌细胞株(Hep G2.2.15)细胞,以拉米夫定作阳性对照药物,噻唑蓝(MTT)法检测甘肃、内蒙古甘草、甘草酸、甘草苷对细胞的生长抑制作用,分别计算抑制率和半数毒性浓度(TC50);酶联免疫吸附(ELISA)法检测药物对细胞表达的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)和乙型肝炎e抗原(HBe Ag)的影响,分别计算抑制率和半数抑制浓度(EC50),最后计算治疗指数(TI)以进行抗HBV作用评价。结果甘肃、内蒙古甘草具有抑制Hep G2.2.15细胞生长,随着药物浓度增大,其抑制率也随之增大。甘肃甘草对HBs Ag、HBe Ag抑制作用的TI值为11.570、6.760,内蒙古甘草为8.360、5.020。结论甘肃、内蒙古甘草提取液在体外均有明显抑制HBV作用,甘肃甘草作用更强。

HepG2.2.15用于中药复方治疗乙型肝炎研究的相关问题探讨

本课题组前期完成了经方小柴胡汤含药血清对HepG2.2.15细胞干预作用的相关研究,在HepG2.2.15用于中药复方治疗乙型肝炎研究过程中摸索出一些经验,现就此细胞培养及相关血清药理学运用等方面内容与心得进行回顾与总结,以期为同仁提供参考与借鉴。

艾叶挥发油对HBV的抑制作用

艾叶是菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥叶,是历史悠久的传统中药,在我国大部分地区分布,具有温经止血、散寒止痛、祛湿止痒等功效[1]。实验[2-3]证明艾叶具有抗菌、平喘、镇咳祛痰、抗过敏、护肝利胆和止血与抗凝血等多种药理活性。艾叶对肝脏有保护作用,可以降低谷丙转氨酶,促进肝功能恢复[4]。研究[5]发现艾叶具有明显的抗肝纤维化作用。

拉米夫定对人肝癌细胞MMP-9及p53蛋白表达的影响

目的探讨拉米夫定作用于人肝癌细胞系Hep G2.2.15后对细胞中基质金属蛋白酶9(MMP-9)及p53蛋白表达的影响。方法不同浓度(100、200、300μg/m L)拉米夫定(拉米夫定100、200、300μg/m L组)作用于Hep G2.2.15细胞不同时间(3、6 d),并设立不应用拉米夫定的Hep G2.2.15细胞作为对照组。MTT比色法测定细胞增殖活性;ELISA法测定细胞培养上清及细胞中MMP-9及p53蛋白相对表达量。结果拉米夫定100、200、300μg/m L组与对照组不同时间细胞增殖活力比较差异无统计学意义(P均>0.05)。作用3、6 d,与对照组比较,拉米夫定各处理组Hep G2.2.15细胞及其培养液中MMP-9及p53蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05)。结论拉米夫定作用后Hep G2.2.15细胞MMP-9及p53蛋白水平降低。

以X区为靶位的siRNAs抑制HBsAg、HBeAg及HBVDNA分泌的体外实验

目的研究以X区为靶位的si RNA对HBV感染细胞模型HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA分泌的抑制作用。方法针对HBV X区设计并化学合成4条si RNAs,观察在不同浓度及不同时间点对Hep G2.2.15细胞分泌HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA的抑制作用。结果si RNA-1 si RNA-2和si RNA-4在20、40、80 nmo L/L浓度时,对Hep G2.2.15细胞HBs Ag、HBe Ag的分泌有明显的抑制作用(P<0.01),并随着浓度的增大,抑制作用有增强趋势;40 nmo L/L浓度的三种si RNA在24、48、72 h时间点,发现随着培养时间的延长,对HBs Ag和HBe Ag分泌的抑制作用逐渐增强(P<0.01),72 h抑制作用达到高峰;72 h时三种浓度的si RNA1、si RNA2、si RNA4对HBV DNA分泌有明显的抑制作用(P<0.05)。结论在体外实验中,化学合成以X区为靶位的si RNAs能有效地抑制HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA的分泌。

替芬泰对HepG2-2.2.15细胞HBV-DNA的抑制作用

目的探讨替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞HBV-DNA的抑制作用。方法以Hep G2-2.2.15细胞作为实验模型,通过MTT法检测替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的毒性,确定替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的半数中毒浓度(TC50)。在替芬泰浓度为50μg·ml-1时未见明显的细胞毒性,所以设替芬泰3个剂量组为50、25、12.5μg·ml-1,拉米夫定50μg·ml-1作为阳性对照药,收集给药3、6 d的细胞。用实时荧光定量PCR法检测DNA载量。结果替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的TC50为180.70μg·ml-1。随着替芬泰药物浓度的增加,Hep G2-2.2.15细胞内的HBV-DNA拷贝数相应减少,并有明显的浓度依赖性。结论替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞内HBV-DNA有显著的抑制作用,有效浓度为12.5μg·ml-1,最佳浓度为50μg·ml-1。

丹参素靶向乙肝病毒逆转录酶抗乙肝及抗原表达影响机制研究

该文采用MTT法测定丹参素对转染人肝癌细胞株(Hep G2)的2.2.15细胞活性的抑制作用,通过间接荧光标记法测定细胞内活性氧水平的变化;采用ELISA法测定细胞上清乙肝表面抗原(HBs Ag)和E抗原(HBe Ag)水平,采用荧光定量PCR法检测HBV DNA水平;利用酶抑制动力学方法,研究了丹参素对HBV RT的抑制作用;最后利用圆二色谱法监测丹参素对HBV逆转录酶二级结构的影响。结果显示丹参素能够对Hep G2.2.15细胞的生长起到良好的抑制作用,半抑制浓度IC50为(15.35±2.43)μmol·L-1;丹参素能显著抑制HBs Ag和HBe Ag表达,同时对HBV DNA复制具有抑制作用;此外,丹参素是一种有效的HBV逆转录酶抑制剂[半抑制浓度IC50为(21.32±2.43)μmol·L-1],荧光标记法检测,细胞内活性氧水平随着丹参素呈浓度依赖性升高;圆二色谱分析表明丹参素诱导HBV逆转录酶的构象发生部分改变,α-螺旋含量逐渐增加。结果表明丹参素能够通过结合HBV逆转录酶,诱导酶的结构变得紧密,而不利于活性中心的形成,最终使HBV逆转录酶活性降低。而这种诱导酶的活性降低直接影响到乙肝病毒DNA的复制,加之抗原水平的降低,增加了丹参素抗乙肝病毒的药效。

miR-122在乙肝相关性肝癌发病机制中的作用

目的探讨mi R-122在乙肝病毒复制和乙肝相关性肝癌发病机制中的作用。方法构建mi R-122表达载体并转染Hep G2.2.15细胞,预测mi R-122作用靶点,Western blot检测转染细胞Gyclin G1蛋白表达,QPCR检测转染细胞和肝癌组织中mi R-122的表达,HBV-DNA定量检测转染组细胞HBV表达,MTT法检测mi R-122对细胞增殖的影响,Annexinⅴ/PI荧光双染技术分析mi R-122诱导的细胞凋亡情况。肝癌组织和配对癌旁组织样本各来自3例乙肝相关性肝癌病人。结果与配对的癌旁组织比较,肝癌组织中mi R-122表达低下。mi R-122转染Hep G2.2.15后表达显著上调而Cyclin G1表达下调,mi R-122转染细胞后明显抑制HBV的复制,并诱导细胞凋亡和抑制增殖(P<0.01)。结论 mi R-122可下调靶基因Cyclin G1的表达,上调mi R-122可以抑制HBV基因的复制并促进HBV相关性肝癌的发生发展。