利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ

目的利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ。方法采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CAⅨ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a(+)表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Westernblot鉴定。结果正确构建pET32a(+)/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58000相对分子质量处有明确的条带。目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%。89.9%的重组蛋白是可溶性的。Westernblot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合。结论在原核系统中成功进行G250/MN/CA Ⅸ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础。

肾癌特异性抗原G250/MN/CAⅨ的克隆及真核表达

目的:克隆人肾细胞癌特异性抗原G250基因,使其能够在真核细胞中表达并锚定修饰于细胞膜上。方法:提取人肾透明细胞癌细胞的总RNA,用RT-PCR扩增出G250基因,插入含有人Igκ链前导信号肽、IgG-Fc和GPI锚定信号肽基因序列的真核表达载体pCI-neo-GPI中;将构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250转染RenCa细胞,利用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光检测G250在细胞中的表达。结果:构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250经测序正确;用各种方法对筛选得到的稳定转染细胞进行检测,均可以发现G250的表达,表达部位为细胞膜。结论:克隆出人肾细胞癌特异性抗原G250基因,且G250在RenCa细胞膜上可以正常表达,为进一步研究肾癌肿瘤疫苗的免疫原性提供了必要的前期准备。

肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAⅨ基因的克隆、表达及鉴定

目的报道G250/MN/CAⅨ基因的克隆,蛋白表达及鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR法扩增G250/MN/CAⅨ全长cDNA,将获得的cDNA片段插入pET22b(+)表达载体,转化BL21大肠杆菌中,以IPTG诱导进行蛋白表达,SDSPAGE凝胶电泳观察结果,实验验证。结果克隆的G250/MN/CAⅨ基因经测序证实序列正确,构建重组质粒pET22b(+)/G250并在原核系统中表达G250/MN/CAⅨ重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论成功完成G250基因克隆,为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。

肾癌G250 MN／CAIX重组质粒DNA免疫效应的初步研究

[目的]观察PCDNA3.0-G250重组质粒在小鼠中诱导产生DNA免疫应答的特点及抑瘤效应。[方法] PCDNA3.0-G250质粒每隔2周肌注射Balb/c小鼠共3次,对照组同法肌注PCDNA3.0质粒。每次免疫10 d后眶后取血,间接免疫荧光法检测血清抗体。6周后取脾细胞观察体外细胞毒效应。同法免疫Balb/c小鼠,第3次免疫时皮下种植sp2/0- PCDNA3.0-G250细胞,观察肿瘤大小及小鼠生存期。[结果]DNA免疫后可检测到特异性抗体,抗体滴度随免疫次数增加逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01)。体外CTL杀伤率与对照组差别有统计学意义。体内实验发现治疗组与对照组抑瘤效应无明显差异(P>0.05)。[结论]G250重组质粒DNA免疫能在小鼠巾诱导产生特异性细胞免疫及体液免疫,无明显体内抑瘤效应。

CAIX/MN/G250 mRNA在肾癌根治术前后表达的检测

目的探讨肾癌相关蛋白CAIX/MN/G250 mRNA在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)手术前后的表达水平及临床意义。方法应用RT-PCR技术检测57例RCC患者癌组织及术前外周血中CAIX/MN/G250 mRNA的表达情况,并选择15例癌旁肾组织、15例正常肾组织及40例健康人外周血作对照,对术前外周血CAIX/MN/G250 mRNA阳性RCC患者术后随访4周,并对其外周血CAIX/MN/G250 mRNA水平进行半定量检测。结果57例RCC患者,其CAIX/MN/G250 mRNA阳性率在外周血中为59.6%(34/57),癌组织中为78.9%(45/57),显著高于对照组(P<0.01)。在肾透明细胞癌患者的外周血及癌组织中,CAIX/MN/G250 mRNA的阳性率分别为76.2%(32/42)和95.2%(40/42),均显著高于相应对照组(P<0.01)。RCC患者外周血及癌组织中CAIX/MN/G250 mRNA阳性率均随临床分期的增加而增加(P<0.01)。34例外周血阳性患者CAIX/MN/G250 mRNA水平术前2h、术后7、14、21和28d分别为0.54±0.13、0.56±0.15、0.34±0.13、0.29±0.18和0.22±0.11。RCC患者外周血CAIX/MN/G250 mRNA水平在肾癌根治术后随时间的推移呈下降趋势(P均<0.05)。结论使用RT-PCR技术检测CAIX/MN/G250 mRNA对肾癌尤其是透明细胞癌有较好的特异性和敏感性。外周血CAIX/MN/G250 mRNA检测可作为肾癌微转移的检测指标用于RCC的诊断、疗效评价及预后判断。

G250、Ki-67和Bax在肾细胞癌组织中的表达与术后生存率的关系

目的检测G250/MN/CA(简称G250)、Ki-67和Bax在肾细胞癌及癌旁组织中的表达,探讨G250在肿瘤发展过程中的作用,以及G250、Ki-67和Bax表达对肾细胞癌患者术后生存率的影响。方法采用免疫组化SP法检测54例肾癌组织和18例癌旁组织中G250、Ki-67和Bax的表达。结果G250、Ki-67和Bax免疫染色位于肾癌细胞的细胞膜、细胞核和细胞质,三者在肾细胞癌与癌旁组织中的阳性表达差异均有统计学意义;Ki-67和Bax在肾细胞癌不同病理分级和临床分期中的阳性表达差异有统计学意义,而G250的阳性表达差异无统计学意义。随访的47例患者中,G250阳性组患者术后远期无瘤生存率低于G250阴性组,但二者间的差异无统计学意义;进一步研究表明G250阳性高表达的患者术后无瘤生存率明显高于低表达者,经Log-rank检验差异有统计学意义。Ki-67阳性组患者术后远期无瘤生存率低于Ki-67阴性组,二者间的差异无统计学意义。Bax阳性组患者术后远期无瘤生存率高于Bax阴性组,二者间的差异有统计学意义。结论G250作为一种新的肾细胞癌特异性标志物,在肾细胞癌尤其是肾透明细胞癌的诊断、筛选方面具有良好的前景,并可能影响患者的术后无瘤生存率,但其表达与肾细胞癌临床分期及病理分级无明显相关;肾细胞癌中Ki-67和Bax的表达与肾细胞癌临床分期及病理分级有明显相关性,后者的表达同时也会影响患者术后的无瘤生存率。联合检测肾细胞癌组织中G250、Ki-67和Bax的表达有利于早期诊断肾细胞癌,并有利于判断患者的预后情况,对临床工作有指导意义。

肾癌G250抗原基因在sp2/0细胞中的表达及其意义

【目的】将G250抗原cDNA片段转染入sp2/0细胞中并获得稳定表达,为G250基因疫苗研究提供实验工具。【方法】用脂质体转染法将鉴定好的重组质粒转染入sp2/0细胞中,经G418筛选得到稳定表达,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光、Western blot检测G250基因在sp2/0细胞中的表达。【结果】转染2周后,筛选出阳性sp2/0细胞克隆,通过RT-PCR证实有G250mRNA转录,间接免疫荧光可以见到阳性细胞,Western blot证实有G250抗原表达。【结论】建立了稳定表达G250抗原的肿瘤细胞模型,为研究基于肾癌G250基因的肿瘤基因疫苗治疗奠定了基础。

抗肾细胞癌异种化G250抗原基因疫苗的构建及真核表达

目的:构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250主要T细胞表位区域、猴和鼠G250部分片段区域融合基因tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中表达。方法:通过基因合成和PCR技术构建人、猴和鼠G250区域融合基因tG250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI-Fc-GPI中;将重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI转染COS7细胞,流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果:tG250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pCI-Fc-tG250-GPI中;流式细胞仪和免疫荧光检测显示,重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI在COS7细胞中得到很好的表达。结论:成功构建了重组质粒pCI-Fc-tG250-GPI,且在COS7细胞中可以有效表达,为以G250抗原为靶点基因疫苗的后续功能研究打下良好基础。

肾癌相关抗原G250-MN/CAⅨ在肾癌疫苗和免疫治疗研究中的应用

肿瘤疫苗主要是通过肿瘤相关抗原,尤其是肿瘤特异性抗原,激活免疫系统产生针对肿瘤的特异性免疫反应来达到治疗目的。G250在肾细胞癌中的特异性表达使它成为肾癌疫苗潜在的靶抗原和肾癌免疫治疗的重要靶分子。本文主要针对以G250-MN/CAⅨ为特异性靶点的肾癌疫苗和免疫治疗研究进展作一综述。

肾癌G250抗原基因真核表达载体的构建和序列测定

目的构建肾癌G250抗原基因编码区序列的真核表达载体并进行序列测定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,将PCR片段定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0,并进行序列测定。结果肾癌组织RT-PCR扩增后,均产生特异性条带,位置在1000 bp和1600 bp之间,与预定相符。pcDNA3.0-G250分别用H indⅢ、XhoⅠ双酶切后产生2条带,均与预定位置相符;抗原基因编码区序列与Genbank登录号BC014950文献报道的序列同源性为100%,目的基因与载体正确连接。结论成功克隆了肾癌G250抗原的基因编码区序列,并构建了其真核表达载体pcDNA3.0-G250,为核素标记的G250单克隆抗体在诊断和治疗的应用及G250基因修饰的树突状细胞疫苗的肾癌生物治疗提供了依据。