Bcl-2硫代反义核酸(G3139)OPC纯化方法

目的 建立 Bcl- 2硫代反义核酸 (G31 39) OPC纯化方法。方法 将 G31 39从合成柱上解离并去保护 ,用 OPC柱分离纯化化学合成的 G31 39,紫外分光光度计测 OD值 ,2 0 % PAGE鉴定其纯度。结果 经 OPC柱纯化后 G31 39制备量可达 mg水平 ,回收率为 6 6 % ,电泳结果显示为一条亮带。结论 Bcl- 2硫代反义核酸 OPC纯化法是一种高效、快速。

载柔红霉素球形B细胞淋巴瘤-2基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸纳米药物的构建及抗白血病的疗效研究

目的设计合成一种新型的自载体球形核苷酸纳米药物用于白血病联合治疗,并对其形貌、理化性质、药物缓释行为及体内外疗效进行研究。方法利用化学反应偶联1,3-二亚麻酸甘油酯(1,3-dilinolenin)和B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(G3139),通过自组装的方式形成具有纳米囊结构的球形核苷酸,并包载化学治疗药物——柔红霉素(DNR),以此构建联合治疗球形核苷酸自载体纳米药物(DBD NP)。通过琼脂糖凝胶电泳检测分子间偶联情况;利用马尔文纳米粒度仪和透射电子显微镜测定其粒径、电位、形貌和稳定性;通过酶标仪检测DBD纳米药物的缓释行为;利用激光共聚焦扫描显微镜观察DBD NP的摄取情况;通过小动物活体成像仪和流式细胞仪研究DBD NP对白血病模型大鼠的治疗效果。结果DBD NP是粒径为140.5 nm球形纳米颗粒,电位为(-26.34±2.66)mV。在模拟血液环境中DBD NP在7 d内具有良好的稳定性,且能持续缓释药物DNR,到第5天累计释放药物量达到76.53%±2.01%。在LT12细胞的摄取实验中,DBD NP组DNR的荧光强度为71.03×10^(5),约是游离DNR组的8倍,表明该纳米颗粒能够显著提高白血病细胞的药物摄取量。动物实验进一步证实DBD NP可显著提高药物的治疗效果,相比游离DNR组,其杀伤白血病细胞的能力提高了2~4倍,将荷瘤大鼠生存期从23 d延长到29 d。结论球形核苷酸纳米颗粒DBD NP能够显著提高药物治疗白血病的效果,延缓大鼠白血病的发病进程,是一种具有一定潜力的新型纳米药物。

载反义寡核苷酸G3139脂质纳米粒的制备及药效学初步评价

反义寡核苷酸G3139(1)可下调B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白和mRNA的表达,从而促进肿瘤细胞凋亡。本研究拟通过基于微流体的两步混合法将1包载于阳离子脂质纳米粒中,从而促进人大细胞肺癌细胞株(NCI-H460)对1的摄取,并且通过加入聚乙二醇化脂质来增加阳离子脂质纳米粒的体内稳定性。结果表明,所得长循环阳离子脂质纳米粒(GLNPs)粒径为(89.6±3.2)nm,ζ电位为(20.9±2.4)mV;琼脂糖凝胶电泳试验和包封率测定结果[(93.6±2.5)%]均显示该脂质纳米粒成功包载了1。GLNPs在NCI-H460细胞中的细胞毒性和细胞摄取均显著优于游离1。在荷NCI-H460肿瘤裸鼠模型中,GLNPs对肿瘤生长的抑制效果也显著优于游离1;并且将GLNPs与紫杉醇注射液联合用药后,抑瘤率为(73.1±10.3)%,显著高于其余单独或联合给药组。体内药效试验中,各组裸鼠的体质量无显著差异,表示本品毒性较低。因此,通过这种两步混合方法制备的GLNPs有望成为一种有应用前景的核酸输送系统。

Innovative progress “Structural optimization and additional target identification of antisense Oligonucleotide G3139 encapsulated in a neutral cytidinyl-lipid combined with a cationic lipid in vitro and in vivo, Biomaterials” by professor Zhenjun Yang's

核酸药物血清稳定性差、难以跨膜及脱靶效应明显等问题严重限制了其在临床上广泛应用。十几年来,核昔(酸)类脂质材料倍受重视,但-直未能实现包载寡核苜酸类药物转染入胞。药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室张礼和院士/杨振军教授研究团队设计合成了一系列以胞嚅呢/胸腺密旋为头部,以油醇甘油醴为疏水尾链.以酯键或酰胺键链接的中性脂材DXBAs(DOTA, DNTA, DOCA. DNCA).其以氢键及zr-it堆积作用与核酸类药物进行识别与结合。

siRNA对肺癌细胞株bcl-2基因表达的抑制

目的研究小干扰RNA(siRNA)对bcl-2基因表达的抑制作用。方法利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA,通过脂质体将合成的siRNA转入A549和NCIH460细胞株,以未转染细胞和转染bcl2的反义药物G3139为对照,经MTT法检测siRNA对细胞生长的抑制,RTPCR检测bcl2mRNA水平,流式细胞仪检测细胞周期的改变和bcl-2蛋白表达,反应siRNA对bcl-2表达的抑制效应。结果siRNA组与对照组细胞存活率各时间点均有显著差异(P<0.05);与反义组在24、48h也有显著差异(P<0.05),而72h无差异(P>0.05)。转染12h后,siRNA组bcl-2mRNA与对照组和反义组有显著差异(P<0.05)。转染48h后,siRNA组bcl2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组和反义组细胞阻滞于S期。结论体外转录合成的siRNA可抑制A549和NCIH46细胞bcl2基因的表达,效率可达50%以上。

脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸诱导Raji细胞凋亡的研究

目的:通过脂质体分别转染bcl-2两个靶点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2)及G3139,观察bcl-2反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞株Raji凋亡的影响。方法:采用MTT法检测药物的半数抑制率(IC50);免疫荧光标记观察细胞bcl-2蛋白水平;用姬姆萨染色和流式细胞仪观察细胞凋亡。结果:MTT测定显示:ASODN1、ASODN2组IC50值分别与G3139组进行比较无显著差异,P>0.05。5μmol/LASODN1、ASODN2作用于Raji细胞72h后,姬姆萨染色均可见凋亡细胞。5μmol/LASODN1、ASODN2和G3139作用于Raji细胞后,bcl-2蛋白阳性率均明显下降,细胞凋亡率均明显增加,P<0.05,但ASODN1、ASODN2组分别与G3139组进行比较无显著差异,P>0.05。5μmol/L无义寡核苷酸对Raji细胞的生长活性、bcl-2蛋白水平及细胞凋亡率均无明显影响,P>0.05。结论:针对bcl-2两个靶点的反义寡核苷酸能特异性促进Raji细胞的凋亡,并且与G3139具有近似的反义效应。