猪源G3BP1基因的稳定敲低PK-15细胞系构建及生物信息学分析

【背景】Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein 1,G3BP1)是应激颗粒(stress granule,SG)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建G3BP1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、塞内卡病毒(seneca virus,SVV)和痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、抗黏病毒蛋白1(myxovirus resistance protein 1,Mx1)、干扰素刺激基因54(IFN-stimulated gene 54,ISG54)和干扰素β(interferonβ,IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Western blotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低G3BP1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P<0.0001),但对VACV的复制无显著影响(P>0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的mRNA表达水平(P<0.05,P<0.0001),敲低G3BP1基因可极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.0001),RT-qPCR结果显示VACV感染可以极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.0001),敲低G3BP1基因对VACV抑制的细胞因子mRNA表达无显著影响(P>0.05);理化性质预测结果显示,猪源G3BP1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测显示,该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(52.47%)组成,主要定位于细胞质和细胞核中,分别占34.38%和31.25%。【结论】本研究获得了猪源G3BP1基因稳定敲低的PK-15细胞系,敲低该基因可极显著促进VSV和SVV的复制,但对VACV的复制无显著影响;敲低该基因可显著或极显著抑制TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的产生;预测该蛋白存在30个磷酸化位点,为非跨膜和非分泌蛋白,具有不稳定性和亲水性。这些结果可为进一步研究G3BP1在病毒感染过程中的作用机制提供工具和参考依据。

G3BP1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。