抗生素G418胁迫条件下转基因水稻种子发芽特性及应用

在不同浓度的抗生素G418胁迫条件下对抗稻瘟病转基因水稻纯系材料D2-1-2及其受体对照中花9号进行了发芽试验。培养7d的结果表明:不同浓度抗生素处理对两个材料萌动无显著的影响;随抗生素浓度的上升,两个材料发根种子数、种子根长、芽长均受到不同程度的抑制;当抗生素浓度达100mg/L时,转基因材料D2-1-2仍可正常长根(平均1.45cm),但中花9号明显受到抑制(平均0.27cm),二者存在明显差异;根据这一特性,从中花9号和D2-1-2混合群体中筛选出来的长根(大于0.5cm)种子经PCR检测88.46%是转基因个体。

G418和氯霉素作为转基因盐藻的抗生素筛选标记

寻找可以作为筛选标记的抗生素是进行盐藻转基因的前提 ,尤其是分子更小、反应更灵敏的抗生素。通过降低培养液中NaCl浓度至 0 2 5mol l以后 ,进行抗生素筛选 ,得到了一种可以作为筛选标记的抗生素———G4 18,70 0 μg/mlG4 18在第 5d即比较完全地杀死野生型盐藻细胞。由于未知的原因 ,实验中氯霉素表现出的抑制浓度是 4 0 0 μg ml,作用时间是 10d以上 ,不同于已有报道。在含 1 5mol lNaCl的盐藻培养基中 ,氯霉素、潮霉素、壮观霉素、G4 18、氨苄青霉素、卡那霉素都没有表现出杀死盐藻细胞的能力。这说明G4

G418抗性HEK293细胞的培育

目的 培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法 通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果 经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论 成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。

甘蔗愈伤组织G418最低抑制浓度的测定

利用新型抗生素G418对 7个有代表性的甘蔗品种(系) (SaccharumofficinarumL. )的愈伤组织进行了最低抑制浓度(MIC)测定,结果发现甘蔗的MIC既有种属共性,又有品种特异性。在受试品种范围内对G418的敏感性有差异,果蔗和部分台糖品种的MIC为 35mg/L,美国高生物量甘蔗品系和福农系列品种的MIC为50mg/L,但与愈伤组织的大小有关。另外发现低浓度的G418有促进甘蔗愈伤组织分化的作用。

抗生素G418在甘蔗组织培养中的最佳筛选浓度

本试验在农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的甘蔗再生体系的基础上,在甘蔗愈伤组织培养的不同阶段,分别加入不同质量浓度的G418选择性试剂,以确定用于甘蔗遗传转化筛选的最适浓度.结果表明,G418对各供试甘蔗愈伤组织的抑制作用相似,愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选质量浓度分别为20-35、15-35和25 mg.L-1.

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体，并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3-4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代，G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。

G418抗性筛选标记在板栗疫病菌中的应用

板栗疫病菌-低毒病毒系统,是一个优良的研究植物病原真菌致病和病毒-宿主相互作用分子机制的模型。随着研究的深入,原有的苯菌灵和潮霉素两个遗传转化筛选标记已不能满足研究需要。文章报道构建一个由构巢曲霉trpC启动子驱动的G418抗性Neo基因盒,并成功应用于板栗疫病菌的遗传转化研究。

Establishment of Protoplast Transformation System in Alternaria tenuissima Using G418 Selection Marker

[Objective] The study aimed to establish a protoplast transformation system in Alternaria tenuissima. [Method] The protoplast of A.tenuissima was firstly prepared by enzymolysis method; then the yielded protoplast was transformed by G418 resistant DNA plasmid using PEG/CaCl2 method. [Result] The growth phenotype and PCR detection showed that resistance gene had integrated into A.tenuissima genome. The transformation efficiency of this method reached per μg DNA 3-4 transformants. After subculture thrice under nonselective condition, G418 resistance could still inherit stably. [Conclusion] The transformation system of A.tenuissima was successfully established, which laid basis for studying of the gene function of Alternaria tenuissima.

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。

流式细胞术结合G418筛选重组质粒稳定转染细胞

目的:探索优化重组质粒转染细胞后的筛选方法,以得到高纯度U937转染细胞。方法:选择带Neor及GFP基因的质粒pRNATU6.1/Neo。根据流式细胞仪可分选GFP阳性细胞这一特点,在质粒转染细胞后比较单用G418筛选与合并使用流式细胞仪分选后的筛选效果。结果:单用G418筛选时最高筛选效率为72.0%;合并使用G418及流式细胞仪分选后的筛选效率均在90.0%以上。结论:合并使用G418及流式细胞仪分选是一种高效的筛选方法。

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL/neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg/ml的G418和300μg/ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。

遗传霉素(G418)纯化许旺细胞过程中成纤维细胞胞浆空泡化的光镜观察

背景:以往研究应用遗传霉素(G418)联合差速贴壁及差速分离法除去成纤维细胞用于许旺细胞的纯化,对纯化过程中成纤维细胞形态变化的描述及可能其原理的推测很少。目的:利用光学显微镜采集纯化的不同时期成纤维细胞和许旺细胞形态学照片,描述成纤维细胞病理学变化。方法:利用差速贴壁、差速分离法结合遗传霉素抑制来纯化大鼠坐骨神经来源的许旺细胞。将传代培养的细胞分2组,实验组:细胞重复一次差速贴壁后转移到另一六孔培养板,每2d更换新鲜纯化培养液,用差速分离法传代。对照组:差速分离纯化1次后转移到另一六孔培养板,每2d更换新鲜基础培养液,用差速分离法传代。在纯化的不同时期,利用光学显微镜观察成纤维细胞病理学变化。结果与结论:在纯化的早期,光学显微镜下不能观察到成纤维细胞的病理变化,但成纤维细胞的增殖速度减慢,持续纯化经过3代(三四周)之后,光镜下可观察到逐渐加重的细胞病理变化,直至细胞空泡化。结果表明,应用遗传霉素纯化许旺细胞过程中,成纤维细胞增殖受限较早,但是胞浆的空泡化延迟至第3次传代及以后发生。

小麦幼苗对抗生素G418敏感浓度筛选试验

为了建立花粉管通道介导的小麦转基因植株的抗生素筛选体系，将小麦种子播种于不同浓度的抗生素G418溶液中，7d后统计各处理小麦幼苗的苗重、苗高、根数、根长、胚芽鞘长等形态指标，结果表明，低浓度的G418即可显著抑制小麦幼苗的苗重、苗高和根长，而对胚芽鞘没有显著的抑制作用；小麦转基因植株G418适宜筛选浓度为25～50mg／L，根长是小麦转基因植株筛选的适宜的形态指标。

不同浓度G418对绵羊耳成纤维细胞的影响

旨在探寻10～14 d内G418致死绵羊耳成纤维细胞的最低浓度。试验设定了100～1000μg/mL的10个G418浓度梯度，加入绵羊耳成纤维细胞培养体系内，培养14 d。结果表明，当G418浓度为200～400μg/mL时，在10～14 d内能致死全部绵羊耳成纤维细胞。

应用G418催芽胁迫体系鉴定携带npt-Ⅱ基因的转育水稻纯系的研究

研究了G418胁迫条件下转育后代的发芽特性和长根类比率,筛选获得了高抗G418的抗性株系,并进行其npt-Ⅱ基因及目的基因的检测与遗传分析。结果表明,转育株系如BM-3、BM-10、BM-13具有高发芽率(>90%)、高生根率(>95%)、低死亡率(<10%)和高长根比率(约为90%),经PCR结果发现这些株系内各单株都含有npt-Ⅱ基因及溶菌酶基因,确为转基因纯合体。进一步证实了G418胁迫催芽技术是可行和实用的,对于npt-Ⅱ基因转育纯系的筛选有重要意义。

以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法建立

为了研究籼稻有效的农杆菌介导二次遗传转化方法,以T-DNA插入突变体M1和M2幼胚为受体材料,通过G418浓度分别为100 mg/L和150 mg/L(20 d/代)的筛选培养基筛选获得的抗性胚性愈伤,转化率最高分别为10.91%和11.05%;分化生根获得M1和M2基因互补转基因水稻植株各143株和180株,经PCR检测阳性率分别达到72.0%和76.1%。试验结果表明,以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法,可以成为水稻遗传改良及基因功能研究的新方法。

G418选择与稳转克隆表达分泌hGM-CSF的相关性考察

目的：进一步考察不同Ｇ４１８维持用量与ｒｈＧＭ－ＣＳＦ表达水平相关性。方法：第２期历时３个月（第４～６个月），本室构建的ＣＨＯ－ｒｈＧＭ－ＣＳＦ稳转克隆，在不同Ｇ４１８维持用量（０、３００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ）下传２５代左右，各批次传代上清用依赖ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞作ＭＴＴ活性测定。结果：无Ｇ４１８选择维持，ＣＨＯ稳转细胞株表达和分泌ｈＧＭ－ＣＳＦ的水平从第４个月开始下降，再次加Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）后，ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达水平迅速回升，２周后至正常。结论：Ｎｅｏ抗性基因作为遗传选择标志进入真核细胞，上述结果对于选择Ｇ４１８用量以维持宿主细胞表达分泌目标蛋白具有一定参考价值。

联合G418筛选构建GFP转基因骨髓基质干细胞系的实验研究

目的联合G418筛选构建绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)系,用于骨髓基质干细胞体外培养及向内耳神经细胞诱导分化的进一步研究。方法制备大鼠骨髓基质干细胞,选用脂质体Lipofectamine^(TM)2000转染方法将含有pcDNA3.1-GFP的重组质粒转染至大鼠骨髓基质干细胞中,荧光显微镜检测GFP蛋白表达,通过G418筛选法建立稳定、含pcDNA3.1-GFP的单克隆骨髓基质干细胞系。结果 500μg/mL的G418压力筛选后,获得了具有G418抗性的绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD大鼠骨髓基质干细胞系。结论成功地培育了G418抗性的GFP转基因大鼠骨髓基质干细胞系,为进行下一步体外特异微环境下的诱导分化提供实验基础。

新生SD大鼠G418耳蜗Corti器离体损伤模型的建立

目的:建立毒性蛋白G418损坏新生大鼠耳蜗毛细胞的离体培养试验模型。方法:应用耳蜗基底膜分离取材技术,耳蜗器官离体培养技术和毛细胞免疫组化染色技术定量观察了G418对新生SD小鼠耳蜗毛细胞的损害。结果:G418对耳蜗毛细胞的有明显的损害,200μg/ml的终浓度,内外毛细胞均有不同程度损害,以外毛细胞为著。结论:G418可用于建立耳蜗Corti器离体损伤模型。

G418抗性基因nptⅡ双元载体的构建及谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化

为给谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)多基因功能的研究提供新的选择标记,利用MYA培养基测G418敏感性后,以质粒pcDNA3.1(+)为中间载体构建nptⅡ基因表达元件,利用根癌农杆菌介导法转化至谢瓦氏曲霉间型变种。结果表明:用构巢曲霉PgpdA启动子、nptⅡ基因和构巢曲霉色氨酸C终止子TtrpC组成的G418抗性基因盒替换双元载体pDHt/sk-bar上的草丁膦抗性盒,成功构建双元载体pDHt/sknt,并且通过根癌农杆菌介导的转化获得的G418抗性转化子遗传稳定,nptⅡ基因主要以单拷贝形式插入谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA中。因此,双元载体pDHt/sknt适用于谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化。