前扣带回皮层中CaMKⅡα^(+)GAD67^(+)神经元在大鼠神经病理性疼痛和焦虑抑郁共病中的作用

目的探讨前扣带回皮层(ACC)中表达钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的兴奋性神经元和表达谷氨酸脱羧酶67(GAD67)的抑制性神经元在神经病理性疼痛以及焦虑、抑郁共病中的作用。方法雄性SD大鼠72只,随机分为假手术组(Sham)、神经病理性疼痛组(CCI)、神经病理性疼痛+CaMKⅡα非激活组(CCI+hM4Di^(-))、神经病理性疼痛+CaMKⅡα激活组(CCI+hM4Di^(+))、神经病理性疼痛+GAD67非激活组(CCI+hM3Dq^(-))、神经病理性疼痛+GAD67激活组(CCI+hM3Dq^(+))。通过由专门设计药物技术激活的设计受体(DREADDs)偶联hM3Dq或hM4Di,以细胞类型和时间依赖性的方式调控神经元活性。以机械缩足阈值(PWT)、热缩足潜伏期(PWL)评估疼痛行为,旷场试验、新环境进食抑制试验、强迫游泳试验评估焦虑、抑郁样行为,WesternBlot检测CaMKⅡα和GAD67表达,c-Fos免疫荧光染色检测神经元激活情况。结果与Sham组相比,CCI组大鼠术后表现出机械痛觉过敏和热痛觉超敏反应以及焦虑、抑郁样行为;对侧ACC中CaMKⅡα蛋白表达水平升高,GAD67蛋白表达水平降低;免疫荧光染色显示CaMKⅡα+神经元激活增多,GAD67^(+)神经元激活减少。与CCI+hM4Di^(-)组大鼠相比,CCI+hM4Di^(+)组在术后28 dPWL、PWT升高,焦虑和抑郁样行为改善。与CCI+hM3Dq^(-)组相比,CCI+hM3Dq^(+)组在术后28dPWL、PWT升高,焦虑、抑郁样行为减少。结论抑制ACC中CaMKⅡα+兴奋性神经元或激活GAD67^(+)抑制性神经元能起到减轻NP大鼠疼痛,改善焦虑、抑郁样行为的作用。

β-细辛醚对青霉素点燃癫痫大鼠额叶皮质FOS、GAD65表达的影响

目的:观察β-细辛醚对青霉素点燃癫痫大鼠额叶脑皮质神经元FOS和GAD65表达的影响。方法:用青霉素点燃大鼠癫痫,大鼠随机分为β-细辛醚高、中、低(100、50、25 mg/kg)剂量组,阳性对照(苯妥英钠)组和阴性对照(基质)组,灌胃给药。用免疫组织化学方法观察癫痫大鼠额叶皮质FOS及GAD65的表达。结果:β-细辛醚能明显上调FOS表达,下调GAD65表达,与阴性对照组比较有显著性差异,并存在明显的量效关系。结论:FOS表达上调可能是β-细辛醚抗癫痫作用的有效环节,GAD65表达减低则可能是β-细辛醚治疗作用的后续影响。

GAD67-GFP精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达

目的:探讨谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备精神分裂症模型后学习与记忆功能的改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定GAD67-GFP基因敲入小鼠,MK-801连续腹腔注射2周制备精神分裂症动物模型,通过悬尾实验、Morris水迷宫实验、免疫荧光标记技术等,观察GAD67-GFP基因敲入小鼠的学习与记忆功能的改变及GABA能神经元在海马齿状回颗粒细胞层的表达。结果:停药后实验组与对照组比较:(1)实验组体重增加明显低于对照组(P<0.05);(2)行为学改变:1悬尾实验:实验组不动时间明显小于对照组(P<0.05);2Morris水迷宫实验:定位航行实验中实验组逃避潜伏期,游泳总路程明显长于对照组(P<0.05),而其平均游泳速度与对照组没有明显差异(P>0.05);空间探查实验中实验组经过平台所在点的次数和在平台所在象限的时间明显小于对照组(P<0.05);(3)在海马齿状回颗粒细胞层中实验组的GFP阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:通过对GAD67-GFP基因敲入小鼠进行腹腔注射MK-801制备精神分裂症模型后,其学习与记忆功能显著下降,且海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元明显增加。提示精神分裂症后学习记忆功能减退可能与GABA能神经元的表达有关。

^(35)S标记重组人GAD_(65)抗原检测糖尿病患者GAD-Ab指数

目的 建立一种新的谷氨酸脱羧酶抗体 (GAD Ab)检测方法。方法 采用重组人GAD6 5质粒 ,经试管内转录与翻译 ,获得35S GAD6 5抗原 ,35S GAD6 5与血清在自制旋转孵育器上旋转保温 ,以蛋白质A 琼脂糖作为沉淀剂 ,用计数仪测沉淀物放射性计数 ,以GAD Ab指数 >0 .0 5作为阳性标准 ,并检测 4 3例 1型和 2 2 6例 2型糖尿病患者 ,以及 10 9例正常对照者的GAD Ab水平。结果 检测条件优化 :采用SJ15 15型35S 蛋氨酸进行试管内转录与翻译 ,自制旋转孵育器转速控制在 2 0～ 30r min ,操作环境温度为 4～ 2 5℃ ,缓冲液最佳pH值为 7.2～ 7.4 ,且新配制使用不宜超过 2周 ,以及采用水平转头离心机等。该方法批内变异系数 (CV)为 4 .9%～ 8.3% ,批间CV为 7.1%～ 10 .8% ,特异性为 98.2 % ,结果与国际标准化实验室GAD Ab检测一致率 98.3% ,Kappa值 0 .971,优于原放射配位体法。该方法检测 1型糖尿病患者阳性率为 5 8.1% (2 5 4 3例 ) ,2型糖尿病患者为 10 .2 % (2 3 2 2 6例 ) ,对照组为1.8% (2 10 9例 ) ,差异均有显著性 (P <0 .0 0 1)。结论 该方法检测GAD Ab灵敏、特异性强、重复性好 ,可望得到广泛应用。

糖尿病患者血清ICA、IAA、GAD-Ab、IA-2-Ab的检测及临床意义

目的 探讨 ICA、IAA、GAD- Ab、IA- 2 - Ab对糖尿病患者的检测及临床意义。方法 用 ELISA法测定 1 5 5例 1型糖尿病患者和 44例 2型糖尿病患者以及 32例正常人血清中的 ICA、IAA、GAD- Ab、IA-2抗体。结果 1型糖尿病组和 2型糖尿病组 ICA的阳性率分别为 36.8%和 1 1 .4% ,IAA的阳性率分别为 2 3.2 %和 1 6.0 % ,GAD- Ab的阳性率分别为 5 8.7%和 1 6.0 % ,IA- 2 - Ab的阳性率分别为 2 0 .0 %和6.8%。结论 ICA、IAA、GAD- Ab、IA- 2抗体对 1型糖尿病的早期诊断及预测有重要的临床意义 ,且联合测定以上抗体能提高检出率 ,避免漏诊。

ICA512/IA-2抗体及GAD抗体联合检测筛查自身免疫中介1型糖尿病

目的 应用ICA5 12 /IA 2抗体与谷氨酸脱羧酶 (GAD)抗体联合筛查中国人糖尿病患者中的自身免疫中介 1型糖尿病。方法 487例中国人 ,按原WHO 1985标准诊断为非糖尿病 10 9例、IDDM 35例及NID DM 34 3例。对象血清ICA5 12 /IA 2抗体及GAD抗体的检测采用放射配体法 ,以人重组ICA5 12 /IA 2及GAD6 5为抗原 (英国RSR公司 )。结果 (1)非糖尿病、IDDM组及NIDDM组ICA5 12 /IA 2抗体阳性率分别为0 .9%、14.3%及 2 .3% (IDDM组比非糖尿病组及NIDDM组P均 <0 .0 0 1) ,GAD抗体阳性率分别为 0 .9%、40 .0 %及 10 .2 % (IDDM组比非糖尿病组及NIDDM组P均 <0 .0 0 1,NIDDM组与非糖尿病组P <0 .0 1)。 (2 )非糖尿病、IDDM组及NIDDM组ICA5 12 /IA 2及 /或GAD抗体阳性率分别为 1.8%、42 .9%及 11.7% (IDDM组比非糖尿病组及NIDDM组P均 <0 .0 0 1,NIDDM组比非糖尿病组P <0 .0 1)。 (3)NIDDM组中的自身抗体阳性者年龄、诊断年龄及病程均小于阴性组 (P <0 .0 5 ) ,应用胰岛素者显著多于阴性组 (P <0 .0 5 )。 75 %阳性者BMI<2 5。 (4)NIDDM组中抗体阳性者在病程≤ 1年、～ 5年及 >5年者中分别占 5 2 .0 %、30 .0 %及 17.5 % (P <0 .0 5 )。结论 在中国人临床表现为NIDDM患者中 ,至少有 12 .0 %为自身免疫中介 1型糖尿病。

GAD室温自交联乳液的合成及其涂膜性能

合成了含有缩水甘油基、羧基和胺基的多层核壳型室温自交联乳液 ,研究了聚合温度、乳化剂用量和加料速率对所得乳液性能及其涂膜性能的影响。研究表明 ,聚合温度升高使乳胶膜的交联密度降低 ,而涂膜耐水性和乳液贮存稳定性在 5 0℃呈现最佳值。在乳化剂含量为 2 %时 ,涂膜的交联密度最大且耐水性最佳 ,而乳液的贮存稳定性随乳化剂用量的增加而增大。加大乳化单体滴加速率 ,乳液贮存稳定性降低 ,乳胶膜的交联密度增大。

谷氨酸脱羧酶(GAD)的研究进展

谷氨酸脱羧酶(GAD,EC4.1.1.15)是生物体内广泛存在的一种酶,有重要的生理学作用,能催化谷氨酸脱羧生成重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)。GAD用于医疗和食品中具有很大潜力,本文综述了GAD的研究进展和应用。

海人酸颞叶癫痫大鼠海马GAD65表达的动态变化

目的探讨GAD65在颞叶癫痫大鼠海马的表达变化及其意义。方法112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3h、6h、12h、24h、48h、7d和30d为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记。用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65蛋白的表达。结果实验组大鼠海马GAD65mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48h￣30d,GAD65mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48h,P<0.05;7￣30d,P<0.01)。结论颞叶癫痫慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的一种内源性抗痫机制。

胰腺癌组织ChAT,GAD65和PKC酶活性的表达

目的:研究ChAT,GAD65和PKC酶活性在慢性胰腺炎和胰腺癌组织中表达特征及其临床病理意义。方法:胰腺癌(n=47)和慢性胰腺炎(n=10)手术切除标本经40g/L中性甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片,ChAT,GAD65和PKC酶活性表达染色方法均为常规ABC免疫组化法。结果:胰腺癌ChAT,GAD65和PKC表达阳性率(48.9％,55.3％和57.4％)及其评分(2.2±1.4,2.2±1.2和2.1±1.6)明显高于慢性胰腺炎阳性率(0％,10.0％和10.0％)及其评分(0.2±0.4,0.6±0.9和0.6±0.9),均有显著或高度显著性差异(P<.05或P<0.01).高分化腺癌ChAT评分值明显高于低分化腺癌(P<0.05),但阳性率之间无明显差异(P>0.05);高分化腺癌GAD65,PKC表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌,均有显著或高度显著性差异(P<0.05或P<0.01)。酶活性表达与胰腺癌患者性别、年龄、有无转移等临床特征均无明显关系。GAD65评分与PKC评分存在高度密切关系(r=0.50,P<0.01)结论。ChAT,CAD65和PKC酶活性表达特征可能与胰腺癌发生发展及生物学行为有密切关系,均为胰腺癌重要生物学标志物。

大鼠GAD65基因的克隆与原核表达

目的构建pGEX-6P-3/GAD65原核表达载体,获得大量纯化的大鼠GAD65蛋白。方法通过RT-PCR技术从大鼠脑组织中扩增GAD65cDNA,克隆至PGEM-Teasy载体上并测序,利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将GAD65基因插入PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定,并用Sepharose4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行酶切。结果扩增的GAD65长度为1758bp,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定,获得PGEX-6P-3GAD65原核表达菌株,获得分子量约91000的PGEX-6P-3/GAD65融合蛋白,分离纯化出约65000的GAD65蛋白,Western-blot表明重组蛋白能被GAD65单克隆抗体特异结合。结论成功获得GAD65蛋白,为研究GAD65生物学作用奠定了基础。

大鼠GAD样、甘氨酸样和SP样阳性终末与三叉神经中脑核神经元接触——Confocal显微镜观察

应用免疫荧光组织化学双重染色和三重染色技术 ,在激光共聚焦显微镜下观察了大鼠三叉神经中脑核 (Vme)内谷氨酸脱羧酶 (GAD)样、甘氨酸 (Gly)样和 P物质 (SP)样阳性终末与磷酸激活的谷氨酰胺酶(PAG)样阳性神经元之间的联系。结果显示 :1几乎所有的 Vme神经元均呈 PAG样免疫阳性 ,这些神经元绝大多数为大的假单极神经元。 2密集分布的 GAD样或 Gly样免疫阳性的神经终扣分别聚集于 PAG样阳性的 Vme神经元胞体周围 ,并与之形成密切接触。3 SP样免疫阳性终末与 PAG样阳性的 Vme神经元形成接触 ,且这些终末中有部分与 5-羟色胺 (5- HT)免疫活性物质共存。以上结果表明 :GABA能、Gly能和 SP能投射至 Vme的神经终末 ,可能在初级神经元即 Vme水平对谷氨酸介导的口面部本体觉信息的传递具有抑制性调控作用。

gAd重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了建立人脂联素球状结构域(gAd)原核高效表达体系,分离纯化gAd并检测其生物活性,从淋巴细胞中提取人基因组DNA,PCR扩增出含有脂联素编码序列的片段,通过T-A克隆的方法克隆入pMD18-T载体中,然后设计适当的引物引入起始密码、终止密码以及相应的酶切位点,把脂联素球状结构域(gAd)基因亚克隆到表达载体pBV220,将序列鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌DH5α中,用42℃温控诱导目的蛋白的表达;超声破菌,分离纯化包涵体,8mol/L尿素溶解,采用梯度稀释法复性重组蛋白,动物实验测定其活性。结果在大肠杆菌中成功实现了gAd稳定的以包涵体形式的高效表达,表达量约占全菌蛋白的20%,经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分离得到的包涵体具有较高纯度,复性后具有降低家兔血糖和游离脂肪酸的作用。为进一步研究gAd的生物学活性、作用机制奠定了基础。

GAD在颞叶癫痫大鼠海马内源性促痫机制中的作用

目的:探讨GAD65、GAD67在颞叶癫痫发生后海马内源性促痫机制中的作用。方法:112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、7天、30天为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记。用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65、GAD67mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65、GAD67蛋白的表达。结果:实验组大鼠海马GAD65 mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48小时～30天,GAD65 mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48小时P<0.05;7～30天P<0.01);海人酸致痫后6小时、24小时实验组大鼠海马的GAD67mRNA及其蛋白表达较对照组增高(分别为P<0.01、P<0.05)。结论:颞叶癫痫急性期海马GAD67表达的增高及慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的内源性抗痫机制。

PD鼠尾壳核内GAD_(67)mRNA的表达及L-Dopa的影响

目的 观察 6 - OHDA毁损黑质及 L- Dopa处理对大鼠尾壳核 (CPu)和苍白球 (GP)功能活动的影响 .方法 6 -OHDA损毁大鼠单侧中脑黑质制备 PD模型大鼠 ,用原位杂交的方法分别观察 PD鼠、L- Dopa处理 PD鼠及对照组鼠CPu及 GP中 GAD6 7m RNA表达水平的变化 .结果 GAD6 7m RNA的表达在 PD鼠 CPu中明显升高 (76 % ) ,在 GP无明显变化 .服用 L - Dopa后 ,GAD6 7m RNA的表达水平在 CPu明显下降 (31% )而在 GP则升高 (4 2 % ) .结论 CPu和 GP功能活动的改变在

1型糖尿病患者血清中抗IA-2与抗GAD_(65)抗体的比较

目的:研究成人1型糖尿病患者血清中抗IA-2抗体和抗GAD65抗体的水平并进行分析。方法:用ELISA法检测了48例20～45岁,病程小于2年的1型糖尿病患者组血清中的IgG型抗IA-2抗体和抗GAD65抗体,并以110例正常人血清作对照组。结果:患者组血清中抗IA-2抗体和抗GAD65抗体的水平与对照组差别均有统计学意义,而且患者组血清中抗IA-2抗体较抗GAD65抗体有更高的阳性率。结论:成人新发1型糖尿病患者血清中IgG型抗IA-2抗体和抗GAD65抗体均有不同程度明显升高,而且对两者进行联合检测会更有助于临床上1型糖尿病的早期诊断。

GAD室温自交联乳液的粒径及其分布

合成得到了含环氧基、羧基和胺基的室温自交联乳液，研究了聚合工艺和乳胶粒结构及组成对乳液粒径及其粒径分布的影响。结果表明：聚合温度对乳液粒径及其分布的影响较小，加大乳化剂用量和乳化单体滴加速率使乳液粒径减小，粒径分布变窄；壳层甲基丙烯酸二甲氨基乙酯用量增加，致仗乳液粒径增大和粒径分布变宽；在合适的中间层分率下获得粒径较小和粒径分布较均匀的乳液；中间层引入（甲基）丙烯酸可减小乳胶粒径，并使粒径分布更均匀。

GAD_(65)基因转染神经干细胞的实验研究

目的检测神经干细胞经谷氨酸脱羧酶(GAD65)基因转染并诱导分化后γ-氨基丁酸(GABA)的表达,为GAD65基因修饰神经干细胞移植治疗癫痫提供理论依据。方法采用新一代高效脂质体作为转染试剂的基因转导方法转染神经干细胞,通过免疫细胞荧光方法鉴定神经干细胞分化为GABA阳性神经元情况。结果采用脂质体转染方法能成功地将GAD65基因转染至神经干细胞中,转染的神经干细胞在分化第7天及第14天GABA阳性神经元分别占(31.9±4.2)%、(26.5±2.3)%,未转染的神经干细胞分化的GABA阳性神经元则分别占(28.4±1.9)%和(20.3±3.5)%,转染者与未转染者相比,分化的GABA阳性神经元百分比有显著性差异(P<0.05)。结论采用脂质体基因转染技术,可以将GAD65基因转染至神经干细胞中,并促进神经干细胞分化为GABA神经元。

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

【目的】克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础。【方法】根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系"新-9-4"的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体。【结果】扩增获得长1962bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%。OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD基因分别位于此载体的两个不同T-DNA区。【结论】克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体。