葡萄VvGAI1与VvJAZ9蛋白互作及低温下的表达模式分析

【目的】DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1,并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析,为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】以酿酒葡萄品种‘霞多丽’叶片为试材,采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置;利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性;利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系;利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体;利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况;通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】从‘霞多丽’叶片中克隆得到VvGAI1,其ORF为1773 bp,编码590个氨基酸,位于第1条染色体,含有1个外显子,无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa,理论等电点p I为5.31,属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域,属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草Nt GAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L^(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明,低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势,VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比,50μmol·L^(-1)茉莉酸甲酯(Me JA)处理可以提高葡萄的抗寒性,50μmol·L^(-1)赤霉素(GA3)处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子,VvGAI1对低温胁迫有响应,外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应,而赤霉素负调控冷胁迫反应。

外源GA3和IAA对烤烟内源激素调控效应和常规化学成分的影响

为了探究外源GA3和IAA对烟草生长及品质的影响,从激素和基因水平探究外源激素作用机理,探索较优激素浓度配比。采用田间试验,以烤烟品种NC71为实验材料,设置不同浓度配比的外源激素,检测了不同时期烤烟株高、干物质积累、激素含量、相关基因表达量的变化和烟叶品质的变化。结果表明,外源GA3可以显著提高烤烟株高和节距,而外源IAA相对提升较少,烟株的干物质量也随着GA3浓度提高而增大。喷施不同浓度外源GA3和IAA均可提高茎尖GA3和IAA含量并降低ABA含量,其中150 mg/L提升效果最明显,100 mg/L外源GA3和10 mg/L外源IAA次之。外源GA3能够使烟草GAI1基因表达量明显下降,IAA也能降低GAI基因的相对表达量,但效果相对较弱。喷施外源激素的烟叶总糖、还原糖、钾含量都有所增加,而总氮、烟碱、氯含量则有所下降,100 mg/L外源GA3与IAA配合施用的条件下钾氯比和糖碱比最高,品质表现较好,可在移栽后15 d喷施100 mg/L外源GA3和10 mg/L外源IAA。这些结果可以为豫中烟区烤烟喷施外源生长调节剂提供依据。