中华按蚊中基于卵巢导向肽和Gal4-UAS结合特性的外源DNA投递系统构建

【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性

目的:确立基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法:将插入上游激活序列(UAS)和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌合酵母活性转录因子(Gal4)、单纯疱疹病毒蛋白(VP16)和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),用免疫沉淀Westernblot分析法检测β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,利用Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果:免疫沉淀Westernblot分析表明A(的生成在γ-分泌酶激活剂神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制剂作用下Aβ的产生呈剂量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论:基于Gal4/vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。

果蝇GAL4/UAS系统在本科遗传学实验中的应用

GAL4蛋白是酵母中的一类转录因子,它能够与特定的上游激活序列结合,并驱动UAS下游基因的表达。将酵母中的GAL4和UAS元件分别引入到果蝇中,含有UAS-目的基因的转基因果蝇品系,无法在亲本中表达,只有与驱动者GAL4品系杂交后的子一代中,目的基因才会表达。在本科遗传学实验中,引入eyelessGAL4和UAS-Ras转基因果蝇品系杂交实验,通过观察F1代复眼中原癌基因ras表达后的表型,使学生了解如何通过GAL4-UAS系统在模式动物黑腹果蝇中实现靶基因的时空表达,认识GAL4-UAS系统在研究果蝇遗传发育中的重要性和优越性,理解分子调控、靶基因表达与个体的遗传和发育每个环节都是可以操作和控制的现代遗传学实验理念。

GAL4/UAS系统在果蝇Tis11基因RNA干扰中的应用

TTP在哺乳动物许多关键基因表达的转录后水平上起调控作用,Tis11是TTP蛋白在果蝇中的同源物.目前还没有现成的可用于研究Tis11功能的基因敲除或敲低的果蝇.为了获得肌动蛋白启动子或者热激蛋白启动子驱动表达Tis11 mRNA干扰序列的具有较高干扰效率的Tis11基因干扰果蝇,将肌动蛋白启动子或者热激启动子驱动表达的GAL4果蝇品系与融合有Tis11 mRNA干扰序列的UAS品系杂交,收集同时带有GAL4基因和UAS序列的子一代果蝇.提取所收集果蝇的总RNA,将其中的mRNA逆转录成cDNA,并设计检测Tis11基因的特异性引物,然后通过Real-time PCR检测Tis11 mRNA的表达情况.结果显示所收集的能表达Tis11基因干扰序列的子一代果蝇与不能表达Tis11基因干扰序列的对照果蝇相比,其体内Tis11 mRNA的表达水平下降明显.收集的果蝇其体内所表达的干扰序列对Tis11 mRNA干扰效果显著,我们成功获得了Tis11基因的RNA干扰果蝇.

GAL4/UAS系统在转基因技术中的应用研究进展

GAL4/UAS系统是一种转基因技术体系,其原理是利用特定的启动子或增强子,以组织特异性的方式激活酵母转录激活子GAL4的表达,GAL4又以同样的方式引起GAL4反应元件(UAS)-靶基因的转录。GAL4/UAS系统的关键点在于:GAL4基因和UAS-靶基因分别存在于两个转基因系中。GAL4转基因系中有转录激活子,但没有靶基因;在UAS-靶基因系中,转录激活子不存在,因而靶基因处于沉默状态,只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交,才可能产生表达靶基因的后代。本文综述了GAL4/UAS系统的建立及其研究应用。

应用GAL4/UAS异位表达系统筛选果蝇视觉基因的研究

目的从GAL4/UAS RNAi系列果蝇中筛选果蝇视觉基因。方法利用GAL4/UAS系统获得nina EGal4/UAS RNAi和Elva-Gal4/UAS RNAi系列果蝇,以nina E-Gal4/+;W1118/+为正常对照,观察RNAi系列果蝇复眼外形结构并检测视网膜电位图(ERG),快速筛选果蝇视觉系统功能基因。结果与正常对照组比较,有5株RNAi果蝇品系复眼外形结构破坏、部分区域刚毛稀少、短且有折断,其视网膜电位(ERG)图谱出现明显异常。结论异位表达法筛选果蝇视觉系统,能揭示作用于视觉神经的基因,为研究其功能提供有意义的资源。

结合GAL4/UAS系统与CyO-GFP平衡子获取表达RNA干扰序列果蝇幼虫并有效干扰Tis11表达

TIS11是转录后调控因子TTP在果蝇中的同源物,在果蝇幼虫免疫、发育和代谢等多种生理过程中都发挥重要作用.为研究TIS11的功能,需要利用GAL4/UAS系统获得整体高干扰效率的Tis11 RNAi果蝇幼虫.为平衡GAL4转基因果蝇高活性启动子的致死效应,需要使用带有成蝇卷翅标记CyO的第二染色体的平衡子,但CyO标记在幼虫中无可见表型,因此无法区分杂交幼虫的基因型.为解决这一问题,引入了带有CyO-GFP标记的平衡子.携带CyO-GFP平衡子的G-Actin果蝇与携带Tis11 RNAi序列的101765果蝇杂交,杂交幼虫可以通过GFP标记进行区分,剔除带有CyOGFP平衡子的幼虫,从而挑选出表达Tis11 RNAi序列的幼虫,最后经real-time PCR检测所得幼虫具有整体高干扰效率.

Gal80^(ts)与Gal4组合灵敏控制果蝇中UAS转基因的表达水平

【目的】Gal80^(ts)与Gal4组合驱动UAS转基因表达是黑腹果蝇Drosophila melanogaster研究中常用的转基因过表达遗传学工具,通过温度控制实现对UAS转基因表达的灵活开关。Gal80^(ts)是一种温度敏感型蛋白,低温下(18℃)与Gal4蛋白结合并抑制其转录活力,高温下(29℃)解除对Gal4的抑制,从而允许Gal4结合UAS位点,启动UAS转基因的表达。但是从18~29℃的开关只能强烈过表达UAS转基因,而不能灵活调控转基因的表达水平。本实验系统研究一系列温度下转基因的表达水平,从而实现该体系对转基因的表达水平的灵活控制。【方法】以果蝇翅芽这一常用器官组织为研究模型,以2种Gal4品系(dpp-Gal4和en-Gal4,分别由decapentaplgic和engrailed基因的启动子驱动)分别与tub-Gal80^(ts)(微管蛋白基因tubulin启动子驱动)基因重组后,再分别与UAS-wg(wingless)转基因品系杂交;在一系列温度(18,25,27.5,28,28.5和30℃)下进行子代幼虫培养,通过免疫组化染色揭示并量化分析转基因wg在3龄幼虫翅芽上的表达水平。【结果】18~25℃培养条件下,Gal80^(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因不能表达;30℃时培养,转基因强烈地过表达;在25~30℃区间内,随着温度升高,转基因表达水平逐渐上升。【结论】在25~30℃之间的温度调控可以实现对Gal80^(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因表达水平的调控。本研究结果对调控转基因表达程度有重要价值。

果蝇在阿尔茨海默病研究中的应用

阿尔茨海默病(AD)是较为常见的慢性神经退行性改变。果蝇遗传背景清晰、实验操作简便、与人类疾病有关的基因或是与其高度相似的同源基因都可以在果蝇体内找到。利用果蝇经典的半乳糖调节上游启动子元件4-上游激活序列(GAL4-UAS)系统已建立了多种AD果蝇模型,开展了AD的分子机制及药物筛选研究。本文针对不同类型的AD果蝇模型的制备原理、方法及应用作一综述,为利用果蝇进行AD研究提供思路。

家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。

mPem蛋白相作用分子的筛选与鉴定

mPem是同源异型框基因,其C末端编码同源异型域。为进一步研究mPem蛋白在胚胎发育和生殖组织发育过程中的作用,利用GAL4酵母双杂交系统筛选小鼠7d胚胎cDNA文库,共获得3个与mPem蛋白相作用的分子。其中之一为Mdfic,一种新的转录调控因子。进一步的酵母双杂交和体外GST_Pulldown试验再次确认两者之间的相互作用。Mdfic与mPem蛋白之间的相互作用暗示两者有可能组成转录调控复合体,共同参与胚胎分化的调控,为两种蛋白功能的研究提供新的思路。

果蝇tap基因表达模式的测定

果蝇tap基因因具有和哺乳动物ngn基因极高的碱基序列相似度,被定性为ngn同源基因。近二十年来,在已知ngn同源基因中,除tap以外,其他基因的功能和调控基本都得到了比较充分的研究,而对tap基因的相应研究几乎停滞。直到利用同源重组技术,将tap基因的编码序列准确地替换成Gal4蛋白的编码序列,培育出tap Gal4品系,并与UAS-GFP品系杂交,通过对子代果蝇中GFP进行荧光染色,明确了tap基因在蕈形体发育过程的表达模式。进而通过量化分析,确定了tap基因在蕈形体发育中不具有原神经功能,而是对神经轴突的生长和靶向延伸起重要作用。主要展示了tap基因在大脑,复眼发育过程中的表达模式,利于针对性地在这些器官中敲除、敲低或过量表达Tap蛋白,进而根据由此产生的表型改变,探究tap基因在这些器官发育中的功能和调控。

tap基因靶向表达导致果蝇神经系统异常发育

[目的]果蝇tap基因编码进化保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白,该研究初步探索其在果蝇神经系统发育中的功能。[方法]合成tap基因的编码序列并亚克隆至p UAST质粒,通过胚胎显微注射和mini-white标记基因筛选,获得UAS-tap转基因果蝇。将该转基因品系分别与ap-GAL4和GMR-GAL4果蝇品系杂交,采用定量RT-PCR方法检测杂交前后tap基因表达水平,并在显微镜下观察杂交后代的发育情况。[结果]成功构建了p UAS-tap重组质粒,通过显微注射与转基因果蝇筛选、平衡及定位,共获得5个独立转基因品系。tap基因靶向表达后引起成虫出现糙眼,翅膀出现异位刚毛和异位翅脉表型。[结论]tap基因可能通过原神经模式,也可能通过调节神经前体细胞分化而参与神经发育。对该基因功能与调控的深入研究,将与脊椎动物中其同源基因ngn的同类研究互相借鉴。