Gal80^(ts)与Gal4组合灵敏控制果蝇中UAS转基因的表达水平

【目的】Gal80^(ts)与Gal4组合驱动UAS转基因表达是黑腹果蝇Drosophila melanogaster研究中常用的转基因过表达遗传学工具,通过温度控制实现对UAS转基因表达的灵活开关。Gal80^(ts)是一种温度敏感型蛋白,低温下(18℃)与Gal4蛋白结合并抑制其转录活力,高温下(29℃)解除对Gal4的抑制,从而允许Gal4结合UAS位点,启动UAS转基因的表达。但是从18~29℃的开关只能强烈过表达UAS转基因,而不能灵活调控转基因的表达水平。本实验系统研究一系列温度下转基因的表达水平,从而实现该体系对转基因的表达水平的灵活控制。【方法】以果蝇翅芽这一常用器官组织为研究模型,以2种Gal4品系(dpp-Gal4和en-Gal4,分别由decapentaplgic和engrailed基因的启动子驱动)分别与tub-Gal80^(ts)(微管蛋白基因tubulin启动子驱动)基因重组后,再分别与UAS-wg(wingless)转基因品系杂交;在一系列温度(18,25,27.5,28,28.5和30℃)下进行子代幼虫培养,通过免疫组化染色揭示并量化分析转基因wg在3龄幼虫翅芽上的表达水平。【结果】18~25℃培养条件下,Gal80^(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因不能表达;30℃时培养,转基因强烈地过表达;在25~30℃区间内,随着温度升高,转基因表达水平逐渐上升。【结论】在25~30℃之间的温度调控可以实现对Gal80^(ts)与Gal4组合系统中的UAS转基因表达水平的调控。本研究结果对调控转基因表达程度有重要价值。

Lac^+酿酒酵母工程菌中GAL80基因敲除对乳糖利用的影响

构建1株可以高效利用乳糖的酿酒酵母工程菌株,以期实现利用乳清生产燃料乙醇,即为燃料乙醇生产提供了新的碳源,又解决了乳清的污染问题。克隆了AY5的GAL80基因,构建敲除质粒pUC-GABCUP。以该质粒为模板PCR扩增同源重组片段GA-CUP1-GB,以Lac+酿酒酵母AY51024M为受体菌株,利用同源重组的方法敲除受体菌株中的GAL80基因,得到1株既解除Gal80抑制又能利用乳糖的菌株AY51024M-G。结果表明,转化子半乳糖利用速率为1.089 g/L·h,较AY51024M提高23.5%;乳糖的发酵周期为60 h,较亲本缩短16.7%;乳糖利用速率为0.852 g/L·h,较AY51024M提高23%;乙醇对乳糖得率为理论得率的89.35%。在Lac+酿酒酵母工程菌中,乳糖代谢与半乳糖代谢密切相关,敲除GAL80有助于提高乳糖的代谢速率,缩短发酵周期。

利用基因工程提高酿酒酵母半乳糖代谢

为了提高酿酒酵母半乳糖利用速率,减弱葡萄糖阻遏半乳糖代谢,研究了负代谢调控基因GAL80,GAL6以及MIG1基因对半乳糖代谢的影响。通过重复利用loxp-Kan MX-loxp抗性基因对GAL80,GAL6以及MIG1基因进行单敲除、双敲除及三敲除,共构建了7株工程菌株。结果表明,7株工程菌株的半乳糖利用速率、乙醇产率均加快。其中,GAL80和MIG1双敲除菌株FY-501α的半乳糖代谢速率为0.916 g·(L·h)^(-1),较亲本提高44.71%,乙醇产率为0.329 g·(L·h)^(-1),较亲本提高46.22%,而在FY-501α基础上继续敲除GAL6得到GY-501α,其半乳糖代谢速率以及乙醇产率均未见提高。7株菌的葡萄糖阻遏效应也得到减弱,其中FY-501α的葡萄糖阻遏效应较亲本减弱42.11%,其次为EY-502α,FY-502α和FY-503α,减弱31.57%。阻断半乳糖代谢途径的负调控基因可以加速半乳糖代谢、减弱葡萄糖阻遏效应。

酵母转录因子Gal4研究进展

胁迫应答基因的转录激活是细胞应答胁迫作用的关键步骤。转录激活因子与启动子顺式作用元件结合是胁迫应答基因转录激活的关键环节。进化保守的Gal4是半乳糖代谢相关基因的转录激活因子。酵母Gal4通过其N端的DNA结合结构域识别并结合启动子UAS,通过其C端的激活结构域与转录因子作用,起始RNA聚合酶Ⅱ复合体的组装和转录。该过程不仅受转录调控因子Gal80和Gal3的调节,还与Gal4二聚体的形成有关。概述了酵母半乳糖代谢相关基因转录激活因子Gal4的研究进展。