基于TCGA分析GALNT14在肾透明细胞癌中的表达及预后意义

本研究拟探索N-acetylgalactosaminyltransferase 14 ( GALNT14)的表达水平对肾透明细胞癌(Kidney Renal Clear Cell Carcinoma, KIRC)的临床预后意义及其在疾病进展中的功能。从The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库获取肾透明细胞癌的临床信息和相应的mRNA表达数据,使用R语言进行差异表达分析和配对差异表达分析,检测 GALNT14在肾透明细胞癌的表达;通过Logistic回归分析、Kaplan-Meier生存分析和COX回归分析探究 GALNT14的表达量与肾透明细胞癌临床特征的相关性;从STRING数据库中获得GALNT14相互作用的蛋白质,通过Linkedomics和GeneMANIA数据库分析GALNT14的蛋白质-蛋白质相互关系;通过基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)探索 GALNT14在肾透明细胞癌中介导的生物信号通路。结果表明,肾透明细胞癌组织中 GALNT14的mRNA相对表达量显著高于癌旁组织;肾透明细胞癌 GALNT14的高表达与肿瘤原发灶大小、Tumor Node Metastasis (TNM)分期、患者年龄、组织分级显著相关;肾透明细胞癌患者 GALNT14的高表达与患者总生存率(Overall Survival, OS)正相关,与无病生存率(Disease Free Survival, DFS)负相关;GALNT14可作为肾透明细胞癌患者的独立预后因子;GALNT14的共调控基因与肾透明细胞癌关系密切;GALNT14的高表达与肿瘤细胞中氨基酸代谢、脂肪酸代谢和糖代谢等信号通路相关。因此, GALNT14在肾透明细胞癌中高表达且与患者预后相关,可作为该疾病的独立预后因子。

GALNT14与MT2A相互作用验证

利用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白沉降实验(GST pull-down),分别从体内外对N-乙酰氨基半乳糖转移酶(GALNT14)与金属硫蛋白2A(MT2A)之间的相互作用进行了验证.将MT2A全长c DNA片段克隆到p ET-Dsb A和p CMV-Myc载体上.表达并纯化了His-Dsba-MT2A和GST-GALNT14蛋白,在体外通过GST pulldown技术分析,显示MT2A能与GALNT14结合,证实了二者在体外的直接相互作用.继而,共转染p CMVMyc-MT2A和p CDNA3.1-Flag-GALNT14到人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过免疫共沉淀实验发现抗Myc抗体可以将GALNT14从细胞裂解液中沉淀下来,证实了它们在胞内的相互作用.结果显示了GALNT14和MT2A在体内外条件下能够发生直接相互作用,这为进一步明确GALNT14的功能及作用机制奠定了基础.

GALNT14与肿瘤

在过去的一个多世纪,许多肿瘤标志物被发现,其中包括多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase,ppGALNAc-T,简称GALNT)家族中的多个成员。GALNT家族是催化黏蛋白O-糖基化修饰的起始酶,其能够影响黏蛋白的O-糖基化,从而影响肿瘤细胞的发生、预后、增殖与迁移等。GALNT14是该家族中最新发现的成员之一,近年的研究发现,GALNT14在多种肿瘤中表达异常,并与肿瘤细胞的发生、侵袭、转移和凋亡等有关。本文主要对GALNT14蛋白的结构特点及其在肿瘤中的作用进行综述,为进一步研究GALNT14与肿瘤发病机制的关系以及作为潜在的药物靶点提供参考。

GALNT14对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响

构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,经G418筛选并建立稳定转染GALNT14细胞株。应用半定量RT-PCR、Western blot检测稳定细胞株GALNT14 mRNA及蛋白表达水平,细胞划痕修复及穿膜试验检测GALNT14基因对MCF-7迁移能力的影响,同时RT-PCR检测GALNT14对MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF等肿瘤浸润转移相关因子表达的影响。结果显示成功构建了真核重组表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,经RT-PCR和Western blot检测显示成功获得了稳定表达GALNT14的MCF-7细胞株;GALNT14能够提高MCF-7细胞株的迁移能力,且能增加侵袭转移相关因子MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF的表达。结论:GALNT14可明显促进MCF-7细胞的迁移,可能在肿瘤侵袭转移中起重要作用。

乙酰氨基半乳糖转移酶14(GALNT14)在毕赤酵母中的表达纯化及活性鉴定

将GALNT14全长编码区克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,构建重组载体pPIC9K-T14,经电转至毕赤酵母GS115中表达,使用G418筛选高表达重组菌,并对诱导条件进行优化,表达产物使用SDS-PAGE分析、Western blot鉴定、Sephadex G-100纯化、最后经HPLC检测活性。结果显示,在提供更好的供氧量条件下,用0.75%甲醇诱导可提高目的蛋白的表达量而降低杂蛋白的表达。培养上清液经SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量约64 kDa;Western blot结果显示在相应分子量处有一条特异性条带;利用Sephadex G-100成功分离纯化了目的蛋白;活性测定结果显示所获得的目的蛋白具有催化活性,为深入研究GALNT14的结构与功能奠定了基础。

乙酰氨基半乳糖转移酶14多抗的制备及鉴定

利用生物信息学方法分析乙酰氨基半乳糖转移酶14(GALNT14)蛋白序列,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备。将该DNA片段插入pET-DsbA,构建原核表达载体pET-DsbA-GALNT14。用IPTG诱导表达蛋白,经镍柱纯化蛋白后免疫新西兰大白兔,获得GALNT14多克隆抗血清。用免疫扩散和免疫印迹检测抗体效价及特异性。结果显示,成功表达并纯化了目的蛋白。免疫动物后获得了效价较高、特异性强的GALNT14多克隆抗体,GALNT14蛋白在人乳腺癌和肾癌细胞株中均有表达。该结果为进一步研究GALNT14的功能及其在肿瘤发生发展的作用方面奠定了基础。