pEGFP-N1/Arf6-T27N重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞株中的表达

目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础。方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞。用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变。结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N。以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移。

GALNT14对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响

构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,经G418筛选并建立稳定转染GALNT14细胞株。应用半定量RT-PCR、Western blot检测稳定细胞株GALNT14 mRNA及蛋白表达水平,细胞划痕修复及穿膜试验检测GALNT14基因对MCF-7迁移能力的影响,同时RT-PCR检测GALNT14对MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF等肿瘤浸润转移相关因子表达的影响。结果显示成功构建了真核重组表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,经RT-PCR和Western blot检测显示成功获得了稳定表达GALNT14的MCF-7细胞株;GALNT14能够提高MCF-7细胞株的迁移能力,且能增加侵袭转移相关因子MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF的表达。结论:GALNT14可明显促进MCF-7细胞的迁移,可能在肿瘤侵袭转移中起重要作用。