miR-874-3p靶向GALNT4调控宫颈癌细胞增殖与凋亡的分子机制研究

目的:研究miR-874-3p是否通过靶向GALNT4影响宫颈癌细胞增殖和凋亡。方法:qRT-PCR和Western blot检测宫颈癌细胞系miR-874-3p、GALNT4 mRNA和GALNT4蛋白表达。HeLa细胞转染miR-874-3p或si-GALNT4,Western blot检测GALNT4、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Cleaved-Caspase-3、β-catenin表达,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。starBase预测与双荧光素酶活性检测分析miR-874-3p和GALNT4的靶向关系。共转染miR-874-3p和pcDNA-GALNT4,观察过表达GALNT4对miR-874-3p过表达诱导的HeLa细胞增殖和凋亡的影响。结果:与宫颈上皮永生化细胞H8相比,宫颈癌SiHa、HeLa、Caski细胞miR-874-3p表达降低,GALNT4 mRNA和蛋白表达增加(P<0.05)。过表达miR-874-3p降低HeLa细胞CyclinD1、β-catenin蛋白表达及细胞增殖率,提高Cleaved-Caspase-3蛋白表达和凋亡率(P<0.05)。抑制GALNT4表达降低HeLa细胞CyclinD1蛋白表达及增殖率,提高Cleaved-Caspase-3蛋白表达和细胞凋亡率(P<0.05)。miR-874-3p靶向调控GALNT4表达。过表达GALNT4可部分反转miR-874-3p过表达对宫颈癌HeLa细胞增殖、CyclinD1、β-catenin蛋白表达的抑制作用,及对细胞凋亡、Cleaved-Caspase-3蛋白表达的促进作用。结论:miR-874-3p通过靶基因GALNT4调控Wnt/β-catenin信号通路,抑制宫颈癌细胞增殖,并诱导其凋亡。

miR-519a-3p通过靶向GALNT4基因调控肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的分子机制

目的探讨miR-519a-3p对肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的影响及分子机制。方法培养正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H_(2)170和PNCI-H1975,RT-qPCR检测细胞中miR-519a-3p和多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶4(GALNT4)mRNA表达水平,Western Blot法检测GALNT4蛋白表达水平。以NCI-H1299细胞为研究对象,分别构建高表达miR-519a-3p或低表达GALNT4的NCI-H1299细胞,Transwell检测细胞迁移和侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-519a-3p与GALNT4调控关系。结果肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H_(2)170和PNCI-H1975中miR-519a-3p的表达显著低于肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05),而GALNT4 mRNA和蛋白的表达显著高于BEAS-2B细胞(P<0.05)。高表达miR-519a-3p或低表达GALNT4降低了NCI-H1299细胞迁移和侵袭数及MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05),而提高了细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达(P<0.05)。miR-519a-3p靶向负调控GALNT4表达。高表达miR-519a-3p后,NCI-H1299细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。与仅高表达miR-519a-3的NCI-H1299比较,同时高表达miR-519a-3p和GALNT4的NCI-H1299细胞迁移和侵袭数及MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT蛋白表达升高(P<0.05),而凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。结论miR-519a-3p在肺癌细胞系中呈低表达,高表达miR-519a-3p可能通过靶向抑制GALNT4表达及PI3K/AKT信号通路的激活减弱肺癌细胞的迁移和侵袭性,并诱导细胞凋亡。

miR-4698介导GALNT4表达对肝癌细胞增殖和迁移的影响

目的检测miR-4698在肝癌组织及细胞系中的相对表达,分析其对肝癌细胞增殖和迁移的影响及分子作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肝癌组织和肝癌细胞系中miR-4698的相对表达。在表达最低的肝癌细胞系中,采用脂质体转染法分别转染miR-4698模拟物和对照模拟物,命名为实验组和对照组。qRT-PCR检测转染效率。细胞计数试剂盒(CCK-8)和Transwell迁移实验分别检测过表达miR-4698对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测并验证miR-4698与靶基因的结合。qRT-PCR和Western blot分别检测靶基因在mRNA水平和蛋白水平的相对表达。结果与癌旁组织相比,miR-4698在肝癌组织的表达明显降低(P<0.01)。与正常肝细胞系相比,miR-4698在肝癌细胞系的表达明显降低(P<0.05),在Huh7细胞的表达最低(P<0.01)。转染后,与对照组相比,实验组Huh7细胞中miR-4698的表达明显增加(P<0.01)。过表达miR-4698可抑制肝癌Huh7细胞的增殖能力(P<0.05)和迁移能力(P<0.05)。生物信息学显示miR-4698的靶基因是多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶4(GALNT4),双荧光素酶报告基因证实miR-4698可互补结合GALNT4(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,过表达miR-4698可抑制GALNT4基因的表达(P<0.01)。Western blot实验显示,miR-4698过表达后,Huh7细胞中GALNT4蛋白表达降低,细胞增殖相关蛋白Cyclin B和CDK1表达降低,细胞转移相关蛋白N-cadherin和ZEB-2表达降低。结论miR-4698在肝癌组织和细胞系中表达明显下降,过表达miR-4698可通过抑制GALNT4基因的表达,降低肝癌Huh7细胞的增殖和迁移能力。

绒山羊4个多胎性状候选基因多态性及其与产羔数的关联分析

【目的】通过对内蒙古白绒山羊4个多胎性状相关基因进行测序和生物信息学分析,深入挖掘与产羔数显著相关的单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,为提升绒山羊高效繁育提供理论依据。【方法】选取阿拉善型、阿尔巴斯型绒山羊母羊244只,利用MultipSeq多重PCR结合二代高通量技术检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)、骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2,B4GALNT2)基因多态性,并对不同SNP位点与绒山羊产羔数进行关联分析。【结果】通过GATK分析共预测得到172个SNPs位点,其中BMPR 1 B、B 4 GALNT 2、BMP 15、GDF 9基因相关SNPs位点分别为95、33、26和18个。GLM模型关联分析发现,10个SNPs位点与白绒山羊产羔数显著相关(P<0.05),进一步进行卡方检验发现,其中7个SNPs位点基因型与产羔数显著相关(P<0.05)。BMPR 1 B基因g.29893723 C>G、g.29897064 G>A、g.29897722 G>A、g.29897734 C>A和g.29938673 C>G位点的CC、GG、GA、CA和CC基因型个体产羔数分别显著高于CG、GA、GG、CC和GG基因型(P<0.05);B 4 GALNT 2基因g.37072289 G>A位点的GG和GA基因型个体产羔数均显著高于AA基因型(P<0.05);GDF 9基因g.66027842 A>C位点的CC和AC基因型个体产羔数均显著高于AA基因型(P<0.05)。【结论】试验获得了内蒙古白绒山羊多胎性状相关基因GDF 9、BMP 15、BMPR 1 B和B 4 GALNT 2的SNPs位点序列特征,发现了与白绒山羊产羔数显著相关的10个SNPs位点,并揭示了不同基因型产羔数间的差异,从而为内蒙古白绒山羊分子辅助育种提供了有力的SNP参考位点。

GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。

版纳微型猪近交系免疫排斥相关基因B4GALNT2的克隆、表达及功能生物信息学分析

为探讨B4GALNT2基因在异种器官移植排斥反应中的作用,以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)为试验动物,研究BMI B4GALNT2基因的序列、结构和表达等特性。通过RT-PCR方法从扁桃体组织中获得B4GALNT2基因cDNA序列,先后应用qPCR和Western Blotting分别检测其mRNA及蛋白质在多种组织中的表达情况,并对蛋白质结构特征进行相关生物信息学分析。获得BMI B4GALNT2 CDS序列1 509 bp,编码502个氨基酸(GenBank核酸登录号:KU358546;蛋白质登录号:ANH21179.1),功能生物信息学分析显示该蛋白含有半乳糖转移酶结构域,有一个跨膜结构,无信号肽。荧光定量结果显示其mRNA在扁桃体、脾脏和淋巴结等重要免疫组织中相对高表达,Western Blotting结果同样显示BMI B4GALNT2蛋白在扁桃体等免疫组织中相对高表达。明确了B4GALNT2基因在BMI多组织中的表达情况,以及B4GALNT2蛋白质的基本结构和功能特征,为进一步深入探究B4GALNT2基因在猪-人异种移植免疫排斥方面的分子机制奠定基础。

采用Gal抗原缺失鼠评价GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织的免疫原性

目的比较在Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织与野生型猪软骨组织所引起的免疫反应。方法将三基因敲除猪软骨组织(KO组)与野生型猪软骨组织(WT组)分别植入Gal抗原缺失小鼠皮下4周,设立假手术组(con)作为阴性对照。4周后抽取小鼠血清检测总IgM抗体和抗Gal抗体。结果野生型猪软骨(WT)材料植入组小鼠总IgM含量平均在(0.525±0.224)mg/ml,显著高于阴性对照(Con)组小鼠总IgM平均含量(0.121±0.050)mg/ml(P<0.05),但与三基因敲除猪软骨(KO)组小鼠总IgM平均含量(0.313±0.061)mg/ml无统计学差异。野生型猪软骨组织具有比三基因敲除猪软骨组织组和对照组更高的抗α-Gal IgM水平(P<0.05),而三基因敲除组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论上述结果表明GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织在体内几乎没有免疫反应,可作为软骨缺损修复材料。

绵羊B4GALNT2和ESR1基因多态性及其与产羔数的关联分析

为探究影响宁夏地区优质肉羊培育中多羔性状的候选位点,试验以杜泊羊、滩寒杂交羊、杂一代、杂二代和横交一代5个绵羊群体为研究对象,采用飞行质谱技术对5个绵羊群体β-1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2,B4GALNT2)基因g.36933082 G>A和g.36946470 G>A位点以及雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)基因g.75378892 A>T位点进行多态性检测,并与绵羊产羔数进行关联分析;应用生物信息学在线软件分析B4GALNT2和ESR1基因突变前后蛋白质的二级结构和三级结构。结果显示,B4GALNT2基因的g.36933082 G>A和g.36946470 G>A位点均存在3种基因型:AA、AG和GG,且GG基因型均为优势基因型;ESR1基因的g.75378892 A>T位点存在3种基因型:AA、TA和TT,且AA基因型为优势基因型。g.36933082 G>A和g.36946470 G>A位点在5个绵羊群体中均表现为低度多态(PIC<0.25),g.75378892 A>T位点在5个绵羊群体中均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5);3个位点在5个绵羊群体中均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。关联分析结果表明,g.36933082 G>A和g.36946470 G>A位点不同基因型在5个绵羊群体中的产羔数均无显著差异(P>0.05);g.75378892 A>T位点在杂一代绵羊群体中TA基因型个体产羔数显著高于TT基因型(P<0.05)。生物信息学结果表明,3个位点均导致对应蛋白质的二级结构和三级结构发生变化。综上所述,B4GALNT2基因g.36933082 G>A和g.36946470 G>A位点不适用于5个绵羊群体多羔性状的选育,ESR1基因g.75378892 A>T位点可作为杂一代绵羊群体多羔性状的分子辅助标记。

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。

山羊B4GALNT2基因的cDNA克隆及组织表达研究

根据绵羊β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(B4GALNT2)(登录号:KC175557)的mRNA序列设计引物,通过RT-PCR技术对高繁金堂黑山羊和单胎藏山羊卵巢组织B4GALNT2基因c DNA进行克隆、序列分析;采用Real-time PCR技术对发情前期山羊卵巢、子宫、输卵管、垂体、肝脏组织中的B4GALNT2基因的表达进行研究。结果表明:山羊B4GALNT2基因编码区全长为1 521 bp,共编码506个氨基酸,2个品种间有6处碱基差异,导致4处氨基酸差异。B4GALNT2基因mRNA在2个山羊品种卵巢、子宫、输卵管、垂体、肝脏中均有表达,在金堂黑山羊子宫和输卵管的表达量显著高于藏山羊(P<0.05)。说明B4GALNT2基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究。