牙龈卟啉单胞菌通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进食管鳞癌自噬

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)促进食管鳞癌(ESCC)细胞自噬发生的分子机制。方法Pg感染siAtg7或氯喹(CQ)预处理的KYSE70细胞和KYSE140细胞,Western blot检测Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白,荧光共聚焦显微镜检测mRFP-GFP-LC3标记ESCC细胞自噬流,CCK-8法检测ESCC细胞活性,迁移小室检测ESCC细胞迁移及侵袭能力。miR-21-5p inhibitor、RASA1过表达或U0126分别阻断miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路,如上检测自噬相关表型变化。免疫组化检测ESCC组织中Pg丰度和LC3蛋白表达,RT-PCR检测ESCC及其癌旁组织中miR-21-5p的表达,统计分析Pg、LC3和miR-21-5p相关性。结果Pg感染诱导KYSE70细胞和KYSE140细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达上调、p62蛋白表达下调,增加了mRFP-GFP-LC3标记细胞中的红色、绿色和黄色荧光斑点数目和荧光强度,同时促进KYSE70细胞和KYSE140细胞增殖、迁移和侵袭能力增加,上述Pg诱导的ESCC细胞表型改变被CQ或siAtg7预处理逆转。miR-21-5p inhibitor、U0126或RASA1过表达质粒的预处理,也同样逆转了Pg对ESCC细胞自噬的促进作用。Pg丰度与miR-21-5p、LC3蛋白表达呈正相关。结论Pg通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进ESCC自噬发生。

推拿对神经病理性疼痛大鼠miR-21-5P、ERK、STAT3的影响

目的 观察在神经病理性疼痛大鼠中miR-21-5P、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinases,ERK)和信号转导和转录活化因子3(Signal transducer and activator of transcription3,STAT3)的表达变化,探究推拿镇痛作用的机制。方法 40只SD雄性大鼠,按照随机分类的方法将其分为正常组、模型组、假手术组、推拿组和假推拿组5个组,每组8只。不给予正常组任何干预措施;模型组、推拿组及假推组建立L5脊神经结扎模型(SNL);只暴露假手术组的脊神经2-3 min;在造模后第1天使用按摩推拿手法模拟仪对推拿组的“环跳”“、阳陵泉”和“悬钟”穴进行推拿治疗,每天1次,每次治疗18 min(双侧),连续干预7天;假推拿组的大鼠则每天给予双后肢18 min的轻轻抚摸,连续干预7天。各组大鼠的机械痛阈值(Paw withdrawl mechanical threshold,PWMT)和热痛阈值(Hindpaw withdrawal thermal latency,PWTL)在造模前1天、造模后第3天和第7天进行测定。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q-PCR)检测造模后第7天各组大鼠中miR-21-5P的表达水平;使用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组大鼠中ERK、STAT3的蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠中白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。结果 术后第3天和第7天,模型组大鼠的机械阈值与热痛阈值比正常组及假手术组的阈值下降(P<0.05),推拿组大鼠的机械阈值与热痛阈值比模型组、假推拿组的阈值升高(P<0.05)。术后第7天,q-PCR检测结果显示,模型组大鼠的miR-21-5P水平较正常组及假手术组的miR-21-5P水平显著增加(P<0.01),推拿组大鼠的miR-21-5P水平较模型组与假推拿组的miR-21-5P水平显著下降(P<0.01);Western blot检测结果显示,与正常组及假手术组比较,模型组大鼠的ERK与STAT3水平显著增加(P<0.01),与模型组、假推拿组比较,推拿组能显著下调大鼠ERK(P<0.05)与STAT3水平(P<0.01);ELISA检测结果显示,模型组大鼠的IL-1β水平较正常组及假手术组的表达增加(P<0.05),推拿组大鼠的IL-1β水平较模型组、假推拿组的表达下调(P<0.01)。结论 推拿可以减轻SNL大鼠的疼痛反应,其机制可能与调控miR-21-5P、ERK、STAT3、IL-1β的表达,从而抑制其介导的炎症反应有关。

LncRNA GAS5通过miR-21/ADAMTS-1途径抑制大鼠肺纤维化

目的探讨生长阻滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)对肺纤维化的影响及分子机制。方法采用生物信息学、荧光素酶报告基因分析GAS5、miR-21、ADAMTS-1间的竞争性内源RNA(ceRNA)关系。SD大鼠分为对照组、LV-GAS5组和LV-GAS5+miR-21 agomir组,经气管内注入博莱霉素A5建立肺纤维化模型后,分别给予尾静脉注射0.2 mL的PBS、LV-GAS5、LV-GAS5+miR-21 agomir。d 28,处死大鼠,收集血液,采用ELISA分析血清PICP和PⅢNP水平,提取肺组织,HE染色和Masson染色观察病理改变,并用qRT-PCR检测GAS5、miR-21、ADAMTS-1表达,Western blot检测ADAMTS-1、ColⅠ、ColⅢ表达。结果GAS5、miR-21、ADAMTS-1之间存在ceRNA调控模式。与对照组比较,GAS5过表达减轻肺组织病理改变,降低血清PICP、PⅢNP水平,上调肺组织GAS5、ADAMTS-1表达,降低肺组织miR-21、ColⅠ、ColⅢ水平(P <0.01)。此外,miR-21agomir处理逆转了GAS5过表达对肺纤维化大鼠肺组织病理改变、胶原沉积和ADAMTS-1表达的影响(P <0.01)。结论GAS5通过内源性吸附miR-21,上调ADAMTS-1表达,促进ColⅠ、ColⅢ降解,减轻肺纤维化病变。

miR-21-5p靶向调控Spry1影响人乳腺癌细胞ERK的磷酸化

目的探讨miR-21-5p在人乳腺癌细胞中调控靶基因影响ERK磷酸化的分子机制。方法利用生物信息学预测miR-21-5p潜在靶基因,双荧光素酶报告实验证实miR-21-5p与预测基因之间的靶向关系;分别转染miR-21-5p mimic和inhibitor及相应阴性对照后,通过RT-qPCR和Western blot检测目的基因的表达。结果Targetscan-human 7.1数据库显示Spry1是miR-21-5p潜在的靶基因;双荧光素酶报告实验显示,与阴性对照组相比,miR-21-5p mimic和psiCHECK2-Spry1-WT共转组荧光素酶强度明显降低(P<0.001)。MCF-7细胞中过表达miR-21-5p,Spry1 mRNA表达无明显变化(P>0.05),Spry1蛋白表达降低(P<0.05),ERK磷酸化水平升高(P<0.05);抑制miR-21-5p表达,Spry1 mRNA表达无明显变化(P>0.05),Spry1蛋白表达升高(P<0.05),ERK磷酸化水平降低(P<0.05)。过表达Spry1后,ERK磷酸化水平降低(P<0.05);干扰Spry1表达,ERK磷酸化水平升高(P<0.05)。结论在人乳腺癌细胞中Spry1是miR-21-5p的靶基因,在转录后水平或翻译水平miR-21-5p可以抑制Spry1的表达,促进ERK的磷酸化。

芪黄健脾滋肾颗粒对肾小球系膜细胞过度增殖的改善作用

目的:探讨芪黄健脾滋肾颗粒改善肾小球系膜细胞增殖的作用及其可能机制。方法:以体外培养的HBZY-1肾小球系膜细胞为模型,模型组采用TGF-β1刺激模拟肾小球系膜细胞过度增殖,血清组在模型组基础上加入芪黄健脾滋肾颗粒含药血清;采用CCK-8法检测肾小球系膜细胞的增殖活力;运用RT-PCR技术检测LncRNA GAS5、miR-21-5p、Sprouty1 mRNA、ERK1/2 mRNA的表达;采用Western blot法检测Sprouty1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达;结果:含药血清在10%浓度下对模型组的异常细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.01);与正常组比较,模型组的ERK1、ERK2 mRNA和磷酸化蛋白及miR-21-5p表达水平均显著升高(P<0.01),GAS5和Sprouty1mRNA的表达则显著降低(P<0.01);与模型组比较,血清组可显著降低ERK1、ERK2 mRNA和磷酸化蛋白及miR-21-5p的表达(P<0.01),以及显著增加GAS5和Sprouty1 mRNA的表达(P<0.01)。结论:芪黄健脾滋肾颗粒可通过上调GAS5的表达,结合mi R-21、增加Sprouty1的表达,降低下游ERK1/2的表达,从而改善肾小球系膜细胞增殖。