NKx2.5、GATA-4基因表达对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

观察NKx2.5、GATA-4基因在骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)分化为心肌细胞过程中表达时序性及表达强度的变化 ,初步阐明两基因对MSCs分化为心肌细胞的影响。以MSCs植入后的Wistar大鼠为研究对象 ,在移植后不同的时间点取心肌标本 ,采用逆转录聚合酶链反应技术 ,提取心肌组织的总RNA ,逆转录 ,加入特异性引物扩增目的基因 ,观察基因表达的时序性 ,并应用凝胶图像分析系统检测这两个基因表达强度的动态变化。显示在MSCs移植后 1d两个基因即出现弱的表达 ,1d～ 1周表达较低 ,2周～ 3周表达强度最高 ,达到高峰期 ,以后表达强度则逐渐降低。NKx2.5、GATA

骨髓间充质干细胞向心肌诱导过程中GATA-4和Nkx2-5基因的表达

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,心肌转录因子GATA-4和Nkx2.5基因表达的变化规律,探讨其分子生物学机理。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代以10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)诱导,分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和Western blot法检测肌钙蛋白I(troponinI,TnI)表达,RT-PCR法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达。结果诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,第1周开始即有GATA-4和Nkx2.5基因表达,逐渐增强,第3周达到高峰,持续到第4周。结论GATA-4和Nkx2.5基因表达在骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导过程中逐渐增强,可能参与调控心肌细胞的分化过程。

过表达GATA-4骨髓间充质干细胞分泌的外泌体促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:前期证明,过表达心脏基因转录因子GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞分泌的外泌体(BMSCs GATA-4-exosome)可以促进BMSCs向心肌样细胞分化,提示其可以修复心肌梗死,另外还发现BMSCs GATA-4-exosome中及心肌梗死局部心肌组织中有miRNA-673-5p明显高表达且功能涉及细胞分化,可能是BMSCs GATA-4-exosome修复心肌梗死的关键分子。目的:探讨BMSCs GATA-4-exosome促进BMSCs向心肌样细胞分化的分子调控网络。方法:在小鼠BMSCs培养体系内加入miRNA-673-5p模拟物(miR-673-5p-mimic)作为实验组(BMSCs miR-673-5p-mimic),将BMSCs GATA-4组、BMSCs GATA-4-空载体组、BMSCs组、BMSCs miR-673-5p-inhibitor组作为混杂因素对照组,提取各组分泌的外泌体与BMSCs直接共培养24 h,采用免疫荧光定性检测和RT-PCR定量检测各组BMSCs中心肌特异性分子α-actin、Desmin、cTnT、Cx43的表达。根据microRNA靶基因预测结果,采用Western blot检测miRNA-673-5p对应靶基因TSC-1、ERK1/2及Mef2c转录蛋白表达。结果与结论:BMSCs miR-673-5p-mimic-exosome+BMSCs组荧光强度最强,心肌细胞特异性分子α-actin、Desmin、cTnT、Cx43的表达最高(P<0.05),TSC-1的表达最低(P<0.05)。结果表明BMSCs GATA-4-exosome通过miRNA-673-5p抑制TSC-1蛋白表达促进BMSCs向心肌样细胞分化。

GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的表达

目的:检测GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的蛋白表达变化。方法:取大鼠胚胎12、15、19天心脏,应用Westernblot、免疫组化的方法进行半定量、定位分析。结果:免疫组化显示,GATA-4基因在房室肌、心内膜、心内膜垫、房室瓣及大动脉根部均有表达。Western blot显示,在胚胎12天心脏中,GATA-4基因已有较高表达;在胚胎15天表达明显上调,胚胎19天时表达又有所下降。结论:GATA-4随大鼠胚胎心脏的生长发育呈动态表达,GATA-4与心脏发育密切相关。

叶酸缺乏对孕鼠子代心脏中GATA-4表达的影响

目的:探讨叶酸缺乏孕鼠的子代心脏发育过程中GATA-4基因和蛋白的表达改变。方法:成熟雌性SD大鼠36只随机分为实验组和对照组各18只,分别喂以缺乏叶酸和添加叶酸的纯合饲料。两周后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕13.5天(E13.5d)、孕17.5天(E17.5d)胚胎的心脏及新生鼠的心脏。用RT-PCR检测GATA-4基因mRNA的表达。Western-blotting测GATA-4蛋白水平的表达。结果:GATA-4基因mRNA在E13.5d、E17.5d的胚胎心脏及新生鼠心脏中的表达量,实验组均显著低于对照组(P<0.05)。GATA-4蛋白在E13.5d、E17.5d的胚胎心脏及新生鼠心脏中的表达量,实验组均显著低于对照组(P<0.05)。结论:叶酸的缺乏影响GATA-4基因和蛋白水平的表达,可能导致心脏发生发育中形态的改变,从而造成心脏的功能缺陷。

GATA-4在小鼠睾丸中的表达定位研究

目的:观察小鼠睾丸内GATA-4免疫反应产物的特征与分布。方法:选取刚出生、2、4、6周雄性B6SJLF1/J小鼠各6只,取睾丸进行石蜡切片,应用免疫组化ABC法,DAB显色,观察GATA-4在不同时期睾丸中的表达情况。结果:GATA-4免疫反应产物在以上4个阶段小鼠睾丸Sertoli细胞、Leydig细胞均有分布,且4、6周组小鼠睾丸Leydig细胞阳性率比刚出生和2周组小鼠更高(P<0.01);但4、6周组小鼠,除以上两种细胞外,生精细胞中也有分布,6周组小鼠比4周组小鼠阳性细胞率高(P<0.01)。结论:小鼠睾丸内存在GATA-4,为研究GATA-4在睾丸性别决定和分化以及激素调控方面提供了形态学依据。

GATA-4过表达增加大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞

目的研究GATA-4转染骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞及表达心肌细胞特异性标志物的能力。方法分离培养MSCs及心肌细胞(CM)。第3代MSCs转染GATA-4基因(MSCGATA-4)并通过实时定量聚合酶链反应(PCR)、Western blot和免疫组化鉴定GATA-4的表达。MSCGATA-4与CM嵌套式共培养1周,通过real-time PCR和Western blot检测其心肌基因BNP、α-actinin和Islet-1的表达,用免疫组化观察α-actinin的表达。与CM混合共培养后1周后,观察MSCs的搏动情况,并用流式细胞仪检测心肌分化率。结果 MSCGATA-4组GATA-4的表达明显高于对照组(只表达GFP)。MSC与CM嵌套式共培养后,MSCGATA-4组的BNP、α-actinin和Islet-1的mRNA和蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)。混合共培养后,可见部分MSCGATA-4的搏动,同时部分MSC的α-actinin染色阳性。用流式细胞仪检测心肌分化率,MSCGATA-4组的心肌分化率明显高于对照组(P<0.05)。结论 GATA-4过表达可以增加MSCs分化成心肌样细胞,高表达BNP、α-actinin和Islet-1。

miRNA-330-3p/Ap2m1轴在过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体抗心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌外泌体(BMSC^(GATA-4)exosome)通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴减少心肌细胞凋亡,提高心肌梗死心功能。方法建立小鼠心梗模型,共分7组,分别经尾静脉注射BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome、BMSC^(miRNA-330-3p-inhibitor)-exosome、BMSC^(空载体)-exosome、BMSCexosome 48 h,同时将心梗未处理组及正常小鼠作为对照组。采用心脏彩超检测各组心功能,RT-PCR检测心梗心肌细胞内miRNA-330-3p的表达,Tunel法检测各组心梗心肌细胞凋亡数量。miRNA-330-3p对应靶基因Ap2.m1、Cnot4蛋白采用Western blot法进行检测。结果BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心功能改善最为明显(P<0.05),其心肌细胞内miRNA-330-3p表达量最高(P<0.05)。BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心肌细胞的凋亡率最低(P<0.05),BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心肌细胞内的Ap2.m1的表达最低(P<0.05)。结论过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞外泌体通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴抗心肌细胞凋亡。

转录因子GATA-4在心肌分化、肥厚及凋亡中的作用

锌指结构家族成员GATA-4作为一种特定的细胞核转录因子,涉及基因调节的不同环节,控制着基因的表达和功能的调节,正日益受到高度重视。该文系统阐述了GATA-4因子的结构、表达及其在心脏发育、心肌肥厚和抗心肌细胞凋亡方面的作用。

低压脉动电刺激对体外心肌诱导分化过程中GATA-4和NKx2.5基因表达的影响

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,低压脉动电刺激对心肌转录因子GATA-4和Nkx2.5基因表达的影响,探讨电刺激对骨髓间充质干细胞向心肌分化过程的影响及其分子生物学机理。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代MSCs,对照组以10μmol/L5-氮胞苷(5-aza)诱导,电场组诱导后施加1.5V/cm电场刺激,分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和western blot技术检测troponin I(TnI)表达,RT-PCR法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达。结果诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,TnI蛋白在诱导后第2周开始表达,第3、4周明显增强。GATA-4和Nkx2.5基因第1周开始表达,第2周增强,第3周达到高峰,持续到第4周。电场刺激组细胞排列更加紧密,诱导后各时间点GATA-4和Nkx2.5基因表达比对照组明显增强。结论脉动电场刺激促进MSCs向心肌细胞的分化过程,GATA-4和Nkx2.5基因可能调节该促进过程。

转录因子Nkx2.5和GATA-4在心脏发育中的作用

转录因子是能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质。Nkx2.5和GATA-4是两个与心脏发育密切相关的转录因子。Nkx2.5参与了心脏形成,包括右侧环化、心腔分化、心脏间隔功能成熟以及工作心肌和传导系统的维持等过程。GATA-4在心肌分化增殖和存活及心脏肥大过程中起重要作用。Nkx2.5和GATA-4在蛋白质水平相互作用,调节心房利钠肽、骨形态发生蛋白和心脏限制性锚蛋白复制蛋白等启动子的表达。

淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞表达GATA-4的影响

目的:探讨淫羊藿苷(ICA)对骨髓间充质干细胞(MSCs)表达锌指转录因子(GATA-4)的影响。方法:把MSCs随机分为6组:正常对照组、4个浓度的ICA组(10-6M、10-7M、10-8M、10-9M)、5-氮胞苷组,每组又分为4个诱导时间组:24 h+1 d、24 h+1 w、48 h+1 d、48 h+1 w。利用RT-PCR方法检测各组的GATA-4表达量。结果:与其他时间组相比,各组在培养24 h+1 w时,GATA-4表达量最高。结论:ICA与MSCs共培养24 h+1 w时,能更好的促进GATA-4的表达。

骨髓间充质干细胞移植大鼠缺血心肌后GATA-4mRNA的表达

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植于大鼠缺血心肌后,心脏早发育基因GATA-4 mRNA的表达。方法设模型组、假手术组和空白对照组,其中模型组采用"冠脉结扎法"建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型。收集从SD雄性大鼠胫骨和股骨骨髓中分离、培养、鉴定后的MSCs,密度调至3×106/100μL悬液,移植于缺血心肌边缘组织的3个位点直接注入共100μL的MSCs细胞悬液,假手术组和空白对照组均在与模型组相同注射部位的3个位点直接注入共100μL的MSCs细胞悬液,28 d后处死大鼠进行相关实验样本处理。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测心肌组织中GATA-4 mRNA的表达。结果 MSCs移植模型组和假手术组的大鼠心肌中存在GATA-4 mRNA的表达;而空白组的心肌中未检出GATA-4 mRNA的表达,对其IOD值半定量分析,模型组高于假手术组和空白组,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。结论 MSCs在进入缺血心肌环境后,细胞内的心肌特异转录过程被再次激活,确立了MSCs向心肌细胞分化的方向。

GATA-4 M310V单基因突变参与家族性房间隔缺损的机制研究

目的:在以往发现家族性先天性房间隔缺损GATA-4 M310V单基因突变的基础上,本研究进一步探讨该突变导致家族性房间隔缺损的可能机制。方法:选取一个先天性房间隔缺损家族(三级亲属成员共31人中有8例单纯性房间隔缺损患者),采集外周血样,采集少量心肌组织标本。体外成功构建GATA-4基因野生型及突变型真核表达载体并转染细胞系,按照不同载体组合(16种组合)转染Hela细胞,应用双荧光素酶报告系统检测GATA-4基因突变对心脏肌球蛋白重链-α(α-Myhc)、心房利钠肽因子(ANF)启动子活性的影响。应用绿色荧光蛋白定位法检测GATA-4 M310V突变对GATA4蛋白核定位的影响。结果:双荧光素酶检测结果:对于α-Myhc启动子,引入GATA-4基因表达载体后,随着GATA-4表达载体浓度的上升,其启动子活性呈现上升趋势,差异有统计学意义(P<0.005);引入GATA-4(A928G)突变基因表达载体后,相同GATA-4表达载体转染剂量(100 ng、200 ng)调控的启动子活性增强,差异有统计学意义(P<0.005);但随GATA-4突变型表达载体引入量的增加(300 ng),启动子活性似乎有下降趋势,差异无统计学意义(P=0.195)。对于ANF启动子,引入GATA-4基因表达载体、GATA-4突变基因表达载体后,启动子活性变化组间差异及趋势变化并不明显(P>0.05)。结论:GATA-4 M310V突变影响了α-Myhc启动子活性及GATA4蛋白的核定位,该突变对GATA4蛋白核定位的影响可能是该突变导致家族性房间隔缺损新的重要分子生物学机制。

过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA

背景:GATA-4是与心脏发育特异相关的锌指样转录因子,前期实验发现过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosome)与BMSCs共培养时可以促使BMSCs表达出更多的心肌特异性抗原。当其与心肌细胞在低氧环境下培养可以抑制心肌细胞的凋亡。目的:探讨过表达GATA-4的BMSCs分泌exosome修复心肌损伤的相关microRNA,从分子水平对其生物学效应进行探讨。方法:(1)通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs,构建过表达GATA-4小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素,然后采用ExoQuick-TC法提取分泌的exosome;(2)实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、空载体-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs单独培养组、心肌细胞单独培养组。培养24 h采用Q-PCR定量检测心肌特异性抗原cTnT、α-actin、connexin 43、Desmin的表达;(3)实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、心肌细胞单独培养组,在低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下培养24 h诱导细胞凋亡。以正常条件下单独培养的心肌细胞作为阴性对照组,采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率;(4)采用Agilent microRNA芯片检测过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA。结果与结论:(1)Q-PCR和流式细胞技术检测结果显示:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化且具有极强的抗凋亡能力;(2)Agilent microRNA芯片检测结果显示:涉及细胞分化的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p(microRNA为上调);mmu-miR-1894-5p(microRNA为下调)。涉及细胞抗凋亡的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p、mmu-miR-20a-5p、mmu-miR-330-3p,这3个基因均为上调。其中mmu-miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡,为重点首先需要验证的microRNA。

先天性心脏病胎儿心肌转录因子GATA-4基因突变检测

目的分析先天性心脏病胎儿中GATA-4基因的突变情况,期望为进一步阐明先天性心脏病发病的分子机理提供新的实验依据。方法应用PCR-DNA测序技术在20例先心病胎儿病变部位的心肌组织中筛查GATA-4基因突变。结果20例中,在1例先心病胎儿(ASD、VSD)中检测到一个突变(V267M),位于外显子4;在3例先心病胎儿中发现编码241位氨基酸(半胱氨酸)密码子的第三位碱基均存在杂合同义突变(C→T),位于外显子3,并证实是一个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs1062215)。结论GATA-4基因突变(V267M)可能与胎儿先天性心脏病发病有关;GATA-4723C/T基因多态性(rs1062215)与胎儿先天性心脏病的关系有待进一步证实。

复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞特异基因GATA-4的表达

目的:观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞特异基因的表达。方法:分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第4代MSCs,观察特异基因GATA-4的表达。结果:大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经含药血清、5-Aza体外诱导大鼠MSCs,细胞上清液中调节心肌发生的专有基因GATA-4的浓度有明显改变。结论:复方丹参滴丸可能有调控心肌发生的专有基因GATA-4的作用,启动细胞向心肌样细胞方向分化。

心脏转录因子Nkx2-5、GATA-4真核表达质粒的构建

目的:构建人类心脏特异性转录因子Nkx2-5、GATA-4的真核表达质粒,探讨Nkx2-5、GATA-4在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法:以质粒人脑c DNA为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2-5、GATA-4编码区序列。将真核表达载体pCDNA 3.1-HA、pCDNA 3.1-flag分别和Nkx2-5、GATA-4的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCDNA 3.1-HA-Nkx2-5、pCDNA 3.1-flag-GATA-4,转化至大肠杆菌,质粒抽提后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果:成功设计引物扩增出Nkx2-5、GATA-4基因编码区约1 kbp及1.3 kbp的目的片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2-5、GATA-4基因序列。结论:成功构建了含有Nkx2.5、GATA4的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。

转录因子GATA-4突变在心脏圆锥动脉干畸形患儿中的研究

目的:研究心脏圆锥动脉干畸形患儿新的分子病因。方法:收集48例圆锥动脉干畸形患儿和100例健康对照者外周血标本,使用血液基因组DNA抽提试剂盒抽提外周静脉血基因组DNA。应用聚合酶链反应扩增GATA-4基因6个外显子编码区和邻近序列后分别直接测序,借助BLAST程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对以识别基因突变。结果:在1例永存动脉干患儿GATA-4基因识别出1个错义突变,即第267位的密码子由GTG变为ATG,亦即c.799G>A(P.V267M)。结论:转录因子GATA-4基因c.799G>A(P.V267M)突变可能与圆锥动脉干畸形的发生有关。

来曲唑诱导多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中GATA-4的表达

目的探讨GATA-4在多囊卵巢综合征(PCOS)发病机制中的作用,并为来曲唑诱导的PCOS模型的应用提供一定的理论依据。方法 40只雌性SD大鼠随机分为模型组和对照组,模型组来曲唑1mg/(kg.d)溶于10g/L羧甲基纤维素(CMC)中,连续灌服21d;对照组给予同体积的溶剂(CMC)灌服。放射免疫法测定大鼠血清性激素水平;HE染色观察卵巢组织学变化;免疫组织化学、实时定量PCR和免疫印迹法检测GATA-4在卵巢组织中的表达。结果模型组血清睾酮(T)、促黄体生成素(LH)、促卵泡刺激素(FSH)浓度显著增高,雌二醇(E2)、孕酮(P)浓度降低。与对照组比较,模型组可见囊状扩张卵泡明显增多,卵巢白膜增厚,黄体数量明显减少。模型组卵巢窦前卵泡和窦状卵泡颗粒细胞GATA-4表达显著增强,卵巢组织中GATA-4mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论卵泡颗粒细胞GATA-4表达异常增高与多囊卵巢综合征的发生密切相关。来曲唑诱导的PCOS动物模型是研究PCOS病理机制的一种理想的动物模型。