小鼠T2细胞特异性转录因子GATA3基因的克隆和序列分析

目的:克隆小鼠Th2细胞分化转录因子GATA3基因的全长编码区cDNA。方法:利用RTPCR方法,从Balb/c小鼠脾细胞的mRNA中扩增GATA3基因全长cDNA,并将其连接到pMD18-T载体上,进行测序和核酸分析。结果:扩增得到的小鼠GATA3基因cDNA全长1332bp,编码444个氨基酸,其结构含有识别和结合DNA所需的高度稳定的蛋白区;blast结果分析表明,该cDNA与Genbank中发表的序列(BC062915)具有100%的同源性。结论:获得小鼠GATA3基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础。

SLE患者PBMCs中T-bet、GATA3和Foxp3 mRNA的表达变化及意义

目的检测系统性统斑狼疮(SLE)患者单个核细胞(PBMCs)中转录因子T-bet、GATA3和Foxp3表达情况,并探讨其意义。方法采集系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs),提取总RNA,利用SYBRGreenⅠ逆转录荧光定量PCR方法,以β-actin为内对照基因,检测PBMCs中T-bet、GATA3和Foxp3mRNA的相对表达水平。结果SLE患者PBMCs中T-bet、GATA3、Foxp3mRNA表达水平低于正常对照组,且活动期高于稳定期。结论SLE患者PBMCs中转录因子T-bet、GATA3和Foxp3表达降低;三者可能参与SLE的发病机制。

GATA3在透明细胞乳头状肾细胞癌中的表达及意义

目的探讨GATA3在透明细胞乳头状肾细胞癌中的表达及意义。方法回顾性分析20例形态学特征符合透明细胞乳头状肾细胞癌,以30例透明细胞肾细胞癌和30例乳头状肾细胞癌为对照组。采用免疫组织化学法检测透明细胞乳头状肾细胞癌中CK7、CAⅨ、GATA3、CD10、P504S及TFE3的表达,组织芯片检测对照组中相关蛋白的表达。结果透明细胞乳头状肾细胞癌均表达CK7和CAⅨ,12例表达GATA3。透明细胞肾细胞癌及乳头状肾细胞癌均不表达GATA3。GATA3对于诊断透明细胞乳头状肾细胞癌的敏感度及特异度分别为60.0%和100.0%。结论 GATA3是一个特异度和敏感度比较高的标志物,可用于区分透明细胞乳头状肾细胞癌与其他形态学相似的肾细胞癌。

靶向沉默Gata3对妊娠期哮喘小鼠树突状细胞表型及效应T细胞失衡表达的影响

目的:研究慢病毒介导siRNA靶向沉默Gata3基因表达对妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)抗原递呈及其免疫生物学特性的影响。方法:以脂质体DNA沉淀法将重组慢病毒干扰质粒与包装质粒共转染AD293细胞,包装生成慢病毒感染体外诱导DC,RT-PCR、Western blot分析其对siGata3基因的整合转录效果;流式细胞术观察细胞表型变化。通过尾静脉注射将pSH1/siGata3转移至小鼠体内,ELISA法测定其肺泡灌洗液(BALF)中的炎性因子含量;MTT法验证混合淋巴细胞反应(MLR)后T细胞增殖能力。结果:经重组、包装携有Gata3特异siRNA慢病毒感染DC成功,其siRNA靶点Gata3 mRNA及蛋白的转录表达分别下调87.30%和81.33%(P<0.05);同时降低DCs膜表面CD86荧光强度(P<0.05)。减少pSH1/siGata3组小鼠BALF中IL-5、IL-17分泌而提升IL-12水平(P<0.05);MLR证实,共培养感染DC激活T细胞的能力明显不足(P<0.05)。结论:siRNA干扰可有效抑制模型小鼠免疫微环境特定Gata3通路,阻遏T细胞及其亚群分化由此来诱导DC免疫耐受,为妊娠期哮喘防治奠定基础并提供新的思路和手段。

GATA3、IL-13基因多态性和IL-13水平与小儿结核病易感性的关系研究

目的探讨GATA3、白细胞介素(IL)-13基因多态性和IL-13水平与小儿结核病易感性的关系。方法随机选取2019年12月至2020年12月在该院诊治的414例小儿结核病患儿作为观察组,另选取456例同期来该院诊治的无肺结核感染的上呼吸道感染患儿作为对照组。提取静脉血DNA,采用Taq-man荧光定量聚合酶链反应技术对GATA3基因的rs422628位点和IL-13基因的rs20541位点进行检测,采用酶联免疫吸附试验检测IL-13水平。统计不同基因型分布频率,并分析不同单核苷酸多态性基因型与小儿结核病发病的风险关系。结果观察组rs422628位点3种基因型TT、TC和CC频率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),rs20541位点的AA基因型频率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。遗传模型分析中rs20541位点隐性模型的OR值为3.349(P=0.008),提示携带rs20541位点AA基因型的儿童患小儿结核病风险较高。同时携带rs422628位点CC基因型和rs20541位点AA基因型的儿童患小儿结核病风险较高(OR=28.500,P=0.043)。观察组血清IL-13水平高于对照组(P<0.05),且携带rs20541位点AA基因型患儿血清IL-13水平高于携带rs20541位点AG和GG基因型患儿(P<0.05)。结论携带IL-13基因rs20541位点AA基因型的儿童对小儿结核病的易感性较高,患病风险较大。

GATA3-IL-13通路基因多态性和IL-13水平与哮喘病的相关性研究

目的:哮喘是一种慢性炎症性呼吸道疾病,有数据表明GATA3-IL-13基因参与哮喘病的生物学理论是可信的。本研究目标是调查哮喘患者中GATA3-IL13通路基因的多态性与IL-13水平的关系,评估在新疆人口中GATA3-IL-13基因多态性与IL-13水平的相关性。方法:279例哮喘患者和277例对照组(健康人)通过Mass ARRAY SNP分型系统进行分析,通过ELISA法检测IL-13的水平,运用SPSS22.0和Graph Pad Prism 6.0软件进行数据统计和分析。结果:哮喘组IL-13水平中(rs2066960 AA),GATA3(rs3781093 CC)基因型与CC(rs2066960)、TT(rs3781093)相比具有增加患病的风险(P<0.05)。同样的,IL-13(rs2066960)C-A等位基因具有增加哮喘患病的风险(P<0.05)。而rs3781093 C-T等位基因没有显著性差异(P>0.05)。结论:哮喘组GATA3(rs3781093)风险性位点发现与哮喘病相关,rs2066960等位基因的C-A突变与血清中IL-13水平的表达有关。

山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

本研究旨在克隆山羊GATA3(GATA binding protein 3)基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。以山羊GATA3基因编码区为种子序列(GenBank登录号:XM_018056969.1),通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GATA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒。利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞。结果显示,山羊GATA3基因编码区序列全长1335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C2093H3234N626O625S24,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高(13.3%),色氨酸含量最低(1.1%)。山羊GATA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7%、94.2%、92.2%、92.4%、88.0%和90.1%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性。系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远。跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中。通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号。本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础。

gata3基因表达与人乳腺肿瘤病理特征的相关性分析

为了检测gata3基因在不同乳腺肿瘤组织中的相对表达情况,分析gata3基因表达与乳腺肿瘤不同临床特征的相关性.自主设计了gata3基因的引物和探针,建立检测gata3基因mRNA表达的一步法qRT-PCR检测方法,进而用建立的方法对130例临床乳腺肿瘤冰冻组织样本中gata3基因的mRNA表达进行检测,并分析gata3基因表达与乳腺肿瘤患者临床病理特征的关系.结果表明:gata3基因mRNA的相对表达量在瘤旁组织中显著高于肿瘤组织(9.1392E-02Vs5.0548E-02,p=0.0071),在良性纤维腺瘤中显著高于恶性肿瘤(6.87E-02Vs3.42E-02,p=0.002);在乳腺浸润性导管癌中,gata3基因的表达与ER表型和Luminal分子亚型显著正相关(rER表型=0.512***;r分型=0.459***);而在Luminal亚型乳腺癌样本中,gata3基因的表达与肿瘤TNM高、分化级别高显著负相关(rTNM分期=-0.111*,r分化=-0.147*).gata3基因异常低表达可能促进乳腺癌的发生、发展和转移,而gata3基因高表达的乳腺癌组织多伴随ER分子高表达,对内分泌药物相对敏感、预后较好.研究建立的gata3基因mRNA表达的一步法qRT-PCR检测方法可以为乳腺癌诊断和预后评估提供新的参考方法.

导致HDR综合征的2例GATA3基因变异的致病性分析

目的分析两个HDR综合征家系的临床特征及致病基因鉴定。方法对两家系成员进行病史、临床信息采集,应用高通量测序和生物信息学分析进行致病基因鉴定。结果在2个家系中仅表现为感音神经性耳聋的先证者的GATA3基因发现两个新发位点,分别为c.186dup(p.Tyr63Leufs*240)和c.835_836dup(p.Gly280Argfs*15),根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传性听力损失判读指南显示,这两突变分别为先证者的致病变异。结论GATA3基因为这两先证者的致病基因,c.186dup(p.Tyr63Leufs*240)和c.835_836dup(p.Gly280Argfs*15)进一步完善了GATA3基因的突变谱。对仅表现感音神经性耳聋的患者,应重视部分表型不完全外显的综合征型耳聋。

2例甲状旁腺功能减低-感音神经性聋-肾发育不良综合征患者临床特点分析

目的探讨2例甲状旁腺功能减低-感音神经性聋-肾发育不良综合征(hypoparathyroidism sensorineural deafness-renal dysplasia syndrome,HDR)患者的临床特征和遗传学病因。方法回顾性分析2例确诊为HDR患者的听力学、基因检测及其他临床资料。结果病例1新生儿听力筛查(耳声发射+自动听性脑干反应)双耳未通过,诊断为中度感音神经性听力损失,随访血钙、甲状旁腺激素检测正常,泌尿系统和甲状旁腺超声检查未见异常。病例2新生儿听力筛查(耳声发射)通过,3岁时体检耳声发射双耳未通过,诊断为中度感音神经性听力损失,随访血钙、甲状旁腺激素检测正常,甲状旁腺超声检查未见异常,泌尿系统超声示双肾小结晶,形态正常。2例经基因检测,诊断为HDR,分别为GATA3基因突变位点c.867dup和c.65_68dup位点突变,患儿双亲均未携带该突变,均为首次报道。结论HDR临床表型差异较大,对听力损伤怀疑合并甲状旁腺功能降低或肾功能异常的患儿应尽早完善基因检测,避免漏诊。

鼻腔滴入IFN-γ对AR大鼠鼻腔黏膜中GATA-3表达的影响及意义

目的探讨鼻腔吸入IFN-γ对大鼠变应性鼻炎(AR)的治疗作用及其机制。方法将32只大鼠随机分为四组,各8只。A组为阴性对照组。B、C、D组采用卵清蛋白、氢氧化铝建立大鼠AR模型,B组为阳性对照组、C组为IFN-γ治疗组、D组为丙酸倍氯米松治疗对照组。B、C、D组于模型建立后第31～38天,每只每日每侧鼻腔分别滴入PBS50μl、IFN-γ1μg和丙酸倍氯米松3.5μg。第39天取鼻腔黏膜,观察鼻腔组织病理学改变,用免疫组化SP法检测转录因子GATA3。结果与A组相比,B组鼻黏膜充血、水肿,黏膜层增厚,有嗜酸细胞为主的炎性细胞浸润,GATA3表达增加;C、D组上述炎性改变明显减轻,鼻黏膜中GATA3表达减少。结论鼻腔滴入IFN-γ治疗AR可能与阻断GATA3表达,从而继发抑制Th2型反应有关。

肾透明细胞癌差异基因的生物信息学分析与验证

目的通过生物信息学(生信学)分析筛选肾透明细胞癌的潜在靶基因,验证并探讨其意义。方法运用生信学分析筛选基因芯片中肾透明细胞癌组织与正常肾组织间的差异基因,通过功能和通路富集分析和构建蛋白相互作用网络筛选核心基因;运用实时定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学检测该基因在肾透明细胞癌组织和对应癌周正常肾组织中的表达水平;通过TCGA数据库分析该基因在肾透明细胞癌中的表达水平及其对生存预后的影响。结果生信学分析筛选出差异表达的核心基因GATA3,其在肾透明细胞癌组织中表达水平显著低于相对应的癌周正常肾组织(P<0.01)。TCGA数据显示GATA3在肾透明细胞癌中的表达水平显著降低(P<0.01),GATA3低表达的肾透明细胞癌患者的生存期显著降低(P<0.05)。结论生信学分析的使用能有助于筛选靶基因并分析其功能,GATA3的差异性表达可能对解释肾透明细胞癌发生、发展机制有一定帮助,并且可能被用作肾透明细胞癌的新型诊断标志物或治疗靶点。

甲状旁腺功能减退-感音神经性耳聋-肾发育不良综合征与GATA3基因突变分析

目的 分析1例甲状旁腺功能减退-感音神经性耳聋-肾发育不良（HDR） 综合征患者的临床特点并对相关GATA3基因突变进行分析。方法 报告1例22岁HDR综合征患者的临床表现、诊治经过及基因检测结果并复习相关文献。结果 患者临床表现为发作性抽搐、听力下降，查体有面神经征及陶瑟征阳性。多次查血钙、甲状旁腺激素均低于正常，纯音听阈测定显示感音性神经性耳聋，腹部彩超提示右肾未探及，考虑右肾缺如，肾功能检查提示肾功能不全。GATA3基因检测提示第六外显子IVS6-1G-A （G/A杂合，splicing），显示在第6外显子上游第一个碱基处有G到A的突变。入院后予补充钙剂及活性维生素D治疗，病情好转。结论 HDR综合征是罕见的内分泌疾病，应提高对本病的认识，避免漏诊[本病例的GATA3基因突变类型IVS6-1G-A至今尚未见报道，为新发现的基因突变位点。

GATA3基因变异导致甲状旁腺功能减退症患者的临床特征和分子机制

目的分析GATA3基因变异导致甲状旁腺功能减退症(hypoparathyroidism,HP)患者的临床特点及分子机制。方法在1975年至2020年间于北京协和医院内分泌科随诊并行靶向基因捕获联合二代测序的198例未成年人(≤18岁)起病的非手术性HP患者中筛查到5例GATA3基因致病/可疑致病性变异,回顾性收集分析其临床资料,并对基因检测结果进行生物信息学分析。结果5例患者HP的起病年龄为0.5(0.1,1.3)岁,发病至诊断为HP和甲状旁腺功能减退-耳聋-肾发育不良(hypoparathyroidism-deafness-renal dysplasia,HDR)综合征的时间分别为(7.0±5.2)年和(15.0±5.4)年。临床表现为手足搐搦伴癫痫样发作、颅内钙化各5例,白内障1例,听力减退4例,肾脏畸形或缺如2例。治疗前血钙和血甲状旁腺激素(PTH)分别为(1.65±0.31)mmol/L和(4.64±2.63)ng/L。5例患者GATA3基因的杂合变异,分别引起无义突变、移码突变和剪接位点突变,经Clin Var数据库预测及美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)分级为致病性或可能致病性变异。结论对于儿童期起病的HP,应注意遗传性疾病的筛查,其中对于合并听力下降或肾脏发育异常的患者要考虑到HDR综合征的可能,有条件时应筛查GATA3基因以明确诊断。

淋巴细胞功能相关抗原-1／细胞间黏附分子-1介导的细胞因子诱导的杀伤细胞体外抑瘤机制

目的 探讨淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）／细胞间黏附分子-1（ICAM-1）介导的细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）的体外抑瘤机制。方法从白血病患儿外周血分离淋巴细胞，经过干扰素-y（IFN-1）、抗CD，单克隆抗体（CD，McAb）、白细胞介素-2（IL-2）诱导并与树突状细胞（DC）共培养，获得大量的DC—CIK。在经10、20μg／ml等不同质量浓度小鼠抗人I．FA一1单克隆抗体处理后，采用Mrrr法研究DC—CIK细胞对多种白血病细胞株的杀伤活性，RT—PCR与Westernblotting方法检测GATA-3和T-bet基因表达水平的变化。ELISA方法测定DC—CIK细胞释放细胞因子IL-12、IFN一叮、肿瘤坏死因子-α[（TNF—d）的表达水平。结果诱导后的DC—CIK细胞形态规则，经不同浓度的LFA-1单克隆抗体处理后，M啊结果：20雌g／mlLFA-1单克隆抗体封闭组DC—CIK细胞对B95细胞杀伤作用下降最为明显（t=10．138，P〈0．05）；RT．PCR与Westernblotting结果：20μg／mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞组，GATA-3基因mRNA水平和蛋白水平表达增加最为明显（仁16．386，P〈0．05：t=22．652，P〈0．05）；同时T—bet基因mRNA水平和蛋白水平表达降低最为明显（t=17．728，p〈0．05；t=7．452，P〈0．05）；ELISA结果：20μg／mlLFA-1单克隆抗体封闭的B95细胞组中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF—d分泌水平下降最为明显（t=21．621，P〈0．05；t=13．739，P〈0．05；t=15．278，P〈0．05）。结论GATA-3和T—bet基因参与了LFA-1／ICAM-1介导的DC—CIK抑瘤途径，并且通过分泌Th1型细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α等发挥抑瘤作用。