原花青素B2通过GATA4/p53通路改善肝细胞衰老的研究

本研究探索了原花青素B2对BNL.CL2肝细胞衰老的拮抗作用。应用棕榈酸(PA)诱导肝细胞衰老细胞模型,通过MTT实验测定PA和PCB2的细胞增殖效应;利用衰老特异性β-半乳糖苷酶试剂盒检测PCB2对细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶表达的影响;通过实时定量PCR检测PCB2对细胞周期相关基因CDK6和p53m RNA表达水平的影响;采用免疫荧光染色法检测PCB2对P53和GATA4蛋白表达以及细胞核大小的影响。结果表明,PA浓度为100μM时能够有效抑制细胞增殖(control:1.289,PA:0.655,p<0.001),而PCB2浓度为12.5μg/m L时可明显改善细胞增殖作用(0.766;p<0.01);与PA组比,PCB2组中表达β-半乳糖苷酶的阳性细胞明显降低;PA诱导细胞核增大(control:1973.9 vs PA:7995.1, p<0.05),而PCB2可降低细胞核大小(3848.8,p<0.05);PA能够诱导衰老相关基因p53表达上调(3.36,p<0.05)和CDK6基因表达下调(0.49,p<0.05),PCB2可有效改善PA诱导的肝细胞衰老(p53:1.11;CDK6:1.01,p<0.05)。免疫荧光染色显示,PA诱导的肝细胞衰老使p53和GATA4共定位于细胞核;经PCB2处理后,p53和GATA4蛋白在核表达减少,且共定位于细胞质中。因此PCB2能够拮抗肝细胞衰老,其可能通过GATA4/p53信号通路发挥作用。

姜黄素通过调控p53/SLC7A11/GPX4通路抑制脂多糖诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化

目的:探讨姜黄素(Cur)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7源性破骨细胞的作用及其机制。方法:用LPS诱导RAW264.7细胞建立破骨细胞模型。CCK-8法检测RAW264.7细胞活力;TRAP染色鉴定破骨细胞形成;TRAP活性测定检测破骨细胞活力;生化检测细胞活性氧(ROS)、Fe^(2+)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11及GPX4蛋白水平。结果:LPS成功诱导RAW264.7细胞为破骨细胞。TRAP染色及TRAP活性结果显示,与LPS组相比,Cur组破骨细胞数量及TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01);与Con组相比,LPS+Erastin组TRAP活性显著升高(P<0.01),经Cur处理后,TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01)。生化检测结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组ROS、Fe^(2+)及MDA水平显著升高,GSH水平显著降低(P<0.01);与LPS+Erastin组相比,Cur组ROS、Fe^(2+)及MDA水平呈剂量依赖式下降(P<0.01),GSH水平呈剂量依赖式上升(P<0.01)。电镜结果显示,与LPS组比较,LPS+Erastin组细胞线粒体嵴减少,膜密度增加;经Cur处理后,细胞线粒体嵴明显增加,膜密度减小。RT-qPCR和Western blot结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组p53的mRNA和蛋白水平显著升高,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.01);经Cur处理后,p53的mRNA和蛋白水平显著降低,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:Cur可抑制LPS诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化,其机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路被抑制有关。

白藜芦醇通过激活p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡减少脑缺血再灌注损伤

目的探讨白藜芦醇对脑缺血再灌注后铁死亡的抑制作用及其机制。方法250~280 g的SPF级SD雄性大鼠63只,随机分为假手术组、脑缺血再灌注组(MCAO/R)组、白藜芦醇组。利用线栓法建立大鼠疾病模型。给药组剂量为30 mg/kg。给药28 d后应用Zea-longa评分评估大鼠神经功能。给药24 h取材大鼠脑组织,通过称重法评估脑水肿情况,应用免疫荧光染色检测谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),长链脂酰辅酶A合成酶4(long chain lipoyl coenzyme A synthetase 4,ACSL4)。试剂盒检测各组脑组织中Fe^(2+)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平。利用蛋白免疫印记(Western Blot)对不同组别的大鼠脑组织中p53、SLC7A11以及GPX4蛋白表达进行检测。结果与损伤组相比,白藜芦醇治疗组Zea-longa评分和脑组织水含量、Fe^(2+)、MDA明显降低,GSH、SOD表达明显增加;免疫荧光染色结果显示,GPX4表达明显增强、ACSL4表达降低。WB通路蛋白结果显示,白藜芦醇治疗组P53表达降低,SLC7A11表达升高。结论白藜芦醇通过调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制MCAO/R大鼠铁死亡,进而促进缺血再灌注大鼠神经功能恢复。

基于p53/SLC7A11/GPX4信号轴探讨七叶内酯诱导小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的作用机制

目的:探讨七叶内酯对小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的影响及其作用机制。方法:对七叶内酯与p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)进行分子对接,并绘制Kaplan-Meier和time ROC曲线。将4T1细胞分为对照组、1/2 IC_(50)组、IC_(50)组、2 IC_(50)组、erastin组和卡培他滨组。采用CCK-8法观察4T1细胞活力情况,筛选药物干预浓度;电镜观察4T1细胞线粒体形态,评估线粒体损伤情况;试剂盒检测4T1细胞活性氧(ROS)、Fe2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和GPX4的水平;采用划痕和Transwell小室实验检测4T1细胞侵袭和迁移能力;Western blot检测p53、SLC7A11、GPX4和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达水平。结果:与对照组相比,七叶内酯1/2 IC_(50)、IC_(50)和2 IC_(50)组细胞活力,GSH和GPX4表达水平,侵袭和迁移能力,以及SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均降低,细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴减少(P<0.05),Fe2+、ROS和MDA水平及p53和ACSL4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:七叶内酯可促进4T1细胞铁死亡,其作用机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路相关。

青蒿琥酯通过p53/SLC7A11/GPX4轴诱导人骨肉瘤细胞铁死亡

目的:探讨青蒿琥酯(Art)对骨肉瘤的促铁死亡作用及其机制。方法:将人骨肉瘤U-2 OS细胞分为4组:正常对照组、ferrostatin-1(Fer-1)组、Art组和Art+Fer-1组。CCK-8法检测细胞活力;生化方法检测细胞ROS、Fe^(2+)和GSH水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化生物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11和GPX4蛋白水平。结果:Art显著抑制了U-2 OS细胞的生长。Art通过促进Fe^(2+)的积累和ROS的形成、抑制GSH的产生,诱发了OS细胞铁死亡,而铁死亡抑制剂Fer-1则抑制了U-2 OS细胞铁死亡。此外,Art还改变了U-2 OS细胞的线粒体形态,表现为线粒体缩小,线粒体膜密度增高,线粒体嵴减少。Art抑制了铁死亡通路上SLC7A11和GPX4 mRNA及蛋白的表达、上调了铁死亡上游调控因子p53的表达,从而诱导铁死亡。结论:Art能通过p53/SLC7A11/GPX4通路诱导骨肉瘤细胞铁死亡。

基因芯片筛选LNCaP与C4-2细胞中P53信号通路相关差异表达基因

目的运用基因芯片筛选雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP与雄激素非依赖性前列腺癌细胞系C4-2中p53信号通路相关差异表达基因,寻找去势抵抗性前列腺癌的可能发生机制。方法体外培养前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2,TRIzol试剂提取两种细胞的总RNA并纯化,按Agilent芯片说明对总RNA进行杂交,所得荧光信号采用Aligent Scanner、Imagene和Genespring软件进行分析和显示。结果以LNCaP为对照,C4-2细胞中3组均表达差异的基因共417个,上调基因301个,下调基因116个。KEGG转录域覆盖率分析显示,差异表达基因中与p53信号通路相关的占9.3%;p53信号通路中表达差异的基因分别为ATR、p21、CDK4/6、Cyclin E、Gadd45、PIGs、CytC、IGFBP3、TSP1、p53R2、Sestrins和Cyclin G,其中p21、CDK4/6、Cyclin E的表达差异最显著。结论筛选出在LNCaP和C4-2细胞系p53信号通路中差异表达基因12个,其中p21、CDK4/6、Cyclin E可能参与了CRPC的发生发展,为进一步研究前列腺癌的进展机制奠定了基础。

HOXA4调控Wnt/β-catenin信号通路对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用

目的:建立人胶质瘤荷瘤裸鼠模型,探讨HOXA4对胶质瘤U251细胞体内生长的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法:采用慢病毒转染,建立胶质瘤U251细胞稳转同源异型盒基因A4 (HOXA4)siRNA细胞系(si-HOXA4)和稳转空载体阴性对照U251细胞系(si-NC)。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞接种于BALB/c裸鼠颈背部皮下,建立荷瘤裸鼠模型,命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。观察各组裸鼠成瘤情况并绘制肿瘤生长曲线;培养21d处死裸鼠后剥离肿瘤组织,测量肿瘤体积和质量;qRT-PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3βmRNA相对表达量;免疫组织化学(IHC)法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平。结果:si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积和质量小于si-NC组和对照组(P<0.05);si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4mRNA相对表达量和HOXA4蛋白表达水平低于其他2组(P<0.05);与si-NC组和对照组比较,si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中CTNNB1mRNA相对表达量降低(P<0.05),β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平亦降低(P<0.05),但Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:抑制人胶质瘤U251细胞HOXA4表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53蛋白的表达,从而抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。

田蓟苷调控p53/NOX4信号通路抗缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的机制

目的:探究田蓟苷(tilianin,Til)预处理对缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2心肌细胞的保护作用。方法:体外培养H9c2心肌细胞,将其分为正常(Normal)组、模型(H/R)组、田蓟苷(Til)组、p53激动剂(Nutlin-3a)组、田蓟苷+p53激动剂(Til+Nutlin-3a)组,缺氧12 h再复氧6 h,建立H/R模型。CCK-8法测H9c2细胞活力,化学荧光法测ROS水平,试剂盒测LDH、MDA、SOD水平,JC-1法测线粒体膜电位(ΔΨm),Annexin-FITC/PI和Fluo-3 AM分别结合流式细胞仪检测细胞凋亡率和Ca^(2+)荧光强度,RT-PCR测定p53、NOX4、Bax、Bcl-2 mRNA表达,免疫蛋白印迹法检测p53、NOX4、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表达,免疫荧光法测定p53、NOX4蛋白表达。结果:相较于H/R组,Til组H9c2细胞活力增强(P<0.01),ROS、LDH、MDA水平下降(P<0.01),SOD水平上升(P<0.01),ΔΨm增强(P<0.01),早期和晚期凋亡细胞降低(P<0.01),Ca^(2+)荧光强度减弱(P<0.01),p53、NOX4、Bax的mRNA和蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白表达上升(P<0.01),Nrf2、HO-1的蛋白表达进一步上升(P<0.01),p53、NOX4阳性细胞表达减少;单独应用Nutlin-3a后上述效应被削弱,而当加入Til后又不同程度逆转Nutlin-3a的效应。结论:Til对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤具有显著的保护作用,该作用可能是通过调控p53/NOX4通路,抑制氧化应激和凋亡实现的。

细胞铁死亡发生机制的研究进展

铁死亡是一种全新的细胞死亡方式,具有独特的形态结构、生物化学及遗传学表现,其本质是铁离子依赖的脂质过氧化产物超量蓄积引起的以线粒体改变为主的氧化损伤。铁离子代谢失衡,诱发机体大量活性氧类与脂质过氧化物的产生,导致细胞铁死亡;而核转录因子红系2相关因子2/谷胱甘肽过氧化物酶4抑制氧化应激是铁死亡的关键信号通路;胱氨酸/谷氨酸反向转运体促进谷胱甘肽的合成;电压依赖性阴离子通道稳定线粒体代谢及离子平衡;p53上调溶质载体家族7成员11的表达,抑制胱氨酸进入细胞内,促进铁死亡。铁死亡与肿瘤、神经退行性疾病、缺血再灌注损伤等有关,但铁离子在细胞铁死亡中的具体作用以及铁死亡与其他细胞死亡方式之间是否存在潜在的相关性需进一步探讨。

电离辐射对小鼠肝细胞铁死亡的影响及机制研究

目的探讨电离辐射对小鼠肝细胞铁死亡的影响及机制。方法应用随机数表法将24只C57BL/6J小鼠分成健康对照组(对照组)6只、照射组18只(全肝单次30 Gy X射线照射),分别于照射后6、24、72 h处死小鼠获取肝组织标本及血浆。采用全自动生化分析仪测定血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)含量,全自动血凝测试仪测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肝组织病理学改变,普鲁士蓝染色检测肝组织铁沉积,免疫组织化学染色检测肝四羟基壬烯醛(4HNE)、铁调素(hepcidin)表达水平,并做定量分析。根据试剂盒说明书采用酶标仪分析测定血浆丙二醛含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽含量。蛋白质印迹法检测肝转铁蛋白受体1(TfR1)、p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。结果与对照组比较,照射组照射后6、24 h小鼠血浆ALT(t=5.15、5.47,P值均<0.001)、AST含量上升(t=8.42、2.50,P值均<0.001),照射后72 h血浆PT延长(t=3.12,P=0.011),APTT缩短(t=3.26,P=0.009)。组织病理结果显示,照射后6、24、72 h肝明显水肿(t=9.58、10.09、18.70,P值均<0.001),出现不同程度的铁沉积(t=8.57、15.31、32.11,P值均<0.001),铁调素阳性细胞在照射后浸润明显增多(t=5.36、13.17、17.11,P值均<0.001),4HNE阳性细胞数明显增多(t=18.86、22.67、9.12,P值均<0.001)。同时电离辐射诱导血浆丙二醛含量显著上升(t=4.36、7.47、8.22,P值均<0.001),SOD减少(t=4.52、5.80、7.60,P值均<0.001),T-AOC减少(t=13.24、20.49、24.96,P值均<0.001),谷胱甘肽减少(t=2.78、6.07、11.25,P=0.020、<0.001、<0.001)。照射后24、72 h,铁死亡标志蛋白TfR1蛋白表达明显上调(t=3.46、5.40,P=0.026、0.006),GPX4蛋白表达下调(t=11.88、30.63,P值均<0.001);照射后6、24、72 h,p53蛋白表达显著上调并保持高水平(t=7.84、4.25、8.22,P=0.001、0.013、0.001),SLC7A11蛋白表达下调(t=9.29、19.96、9.09,P值均<0.001)。结论电离辐射诱导肝细胞发生铁死亡,且其作用机制可能与激活p53-SLC7A11-GPX4通路有关。

首乌丸对衰老大鼠肝肾组织的作用及机制研究

目的观察首乌丸对D-半乳糖致衰大鼠肝肾组织中SIRT1、p53、p21、FoxO4、DNMT1的影响,以探讨首乌丸延缓衰老的作用及可能机制。方法大鼠随机分为正常组、模型组、首乌丸组、维E组。模型组、首乌丸组、维E组用D-半乳糖造成衰老模型,造模同时首乌丸组以首乌丸混悬液灌胃,维E组以维生素E混悬液灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,连续6周。HE染色观察肝肾组织病理改变,三标免疫荧光染色观测大鼠肝肾组织p53、p21、SIRT1的表达,WB检测大鼠肝肾组织FoxO4的蛋白表达量,qPCR检测大鼠肝肾组织DNMT1 mRNA的表达。结果首乌丸可明显改善衰老大鼠肝细胞的脂肪变性以及肾脏结缔组织增生、肾小管扩张等病理改变。同时提高衰老大鼠肝肾组织中SIRT1阳性率,降低p53阳性率及p21阳性率,降低FoxO4蛋白表达量,促进DNMT1mRNA的表达。结论首乌丸可能通过上调肝肾组织中SIRT1的水平,抑制p53、p21及FoxO4的表达,促进衰老细胞凋亡,增强细胞的活性,同时上调DNMT1表达以增强肝肾组织的DNA甲基化水平,从而延缓衰老。