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GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位
1
作者
李丹妮
刘云鹏
《中国医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第1期22-26,共5页
目的采用大引物法构建GATA1不同激酶活性突变体GATA1 S161A S187A(死型)和GATA1 S161D S187D(激活型)真核表达载体,并证实其融合蛋白在细胞内的表达及定位,旨在进一步探讨其生物学功能和潜在肿瘤治疗靶点。方法以GFP-GATA1 WT为模板,采...
目的采用大引物法构建GATA1不同激酶活性突变体GATA1 S161A S187A(死型)和GATA1 S161D S187D(激活型)真核表达载体,并证实其融合蛋白在细胞内的表达及定位,旨在进一步探讨其生物学功能和潜在肿瘤治疗靶点。方法以GFP-GATA1 WT为模板,采用大引物法扩增S161A S187A、S161D S187D突变体片段,双酶切克隆至p EGFP-C1表达载体中,将重组质粒转染至HEK293中,经免疫印迹鉴定融合蛋白的表达。结果用大引物PCR法成功构建GATA1不同激酶活性突变体的真核表达载体p EGFP-GATA1 S161A S187A和p EGFP-GATA1 S161D S187D,验证了其融合蛋白表达。共聚焦激光显微镜技术显示,融合蛋白主要定位于细胞核内。结论利用大引物法成功构建GATA1不同激酶活性突变体真核表达载体,并为进一步进行该突变体的结构和功能研究奠定了基础。
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关键词
GATA1
PAK5
磷酸化
基因克隆
融合蛋白
转染
下载PDF
职称材料
GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探
2
作者
李霞
李晓红
+2 位作者
周涯
马峰
张勇刚
《生命的化学》
CAS
2023年第3期443-453,共11页
本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记...
本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34^(+)、CD43^(+)及CD45^(+)细胞增多,但GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株,并发现其在造血分化时有重要作用。
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关键词
GATA1
GATA1s
多能干细胞
基因敲入技术
聚簇规则间隔短回文重复序列
CRISPR相关蛋白
造血分化
原文传递
题名
GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位
1
作者
李丹妮
刘云鹏
机构
中国医科大学附属第一医院肿瘤内科
出处
《中国医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第1期22-26,共5页
基金
国家自然科学基金(81372546)
文摘
目的采用大引物法构建GATA1不同激酶活性突变体GATA1 S161A S187A(死型)和GATA1 S161D S187D(激活型)真核表达载体,并证实其融合蛋白在细胞内的表达及定位,旨在进一步探讨其生物学功能和潜在肿瘤治疗靶点。方法以GFP-GATA1 WT为模板,采用大引物法扩增S161A S187A、S161D S187D突变体片段,双酶切克隆至p EGFP-C1表达载体中,将重组质粒转染至HEK293中,经免疫印迹鉴定融合蛋白的表达。结果用大引物PCR法成功构建GATA1不同激酶活性突变体的真核表达载体p EGFP-GATA1 S161A S187A和p EGFP-GATA1 S161D S187D,验证了其融合蛋白表达。共聚焦激光显微镜技术显示,融合蛋白主要定位于细胞核内。结论利用大引物法成功构建GATA1不同激酶活性突变体真核表达载体,并为进一步进行该突变体的结构和功能研究奠定了基础。
关键词
GATA1
PAK5
磷酸化
基因克隆
融合蛋白
转染
Keywords
gatai
PAKS
phosphorylation
gene cloning
fusion protein
transfect
分类号
R730-23 [医药卫生—肿瘤]
下载PDF
职称材料
题名
GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探
2
作者
李霞
李晓红
周涯
马峰
张勇刚
机构
中国医学科学院北京协和医学院输血研究所
出处
《生命的化学》
CAS
2023年第3期443-453,共11页
基金
国家自然科学基金面上项目(82170121)
国家自然科学基金青年项目(82000119)。
文摘
本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34^(+)、CD43^(+)及CD45^(+)细胞增多,但GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株,并发现其在造血分化时有重要作用。
关键词
GATA1
GATA1s
多能干细胞
基因敲入技术
聚簇规则间隔短回文重复序列
CRISPR相关蛋白
造血分化
Keywords
gatai
gatai
s
multipotent stem cells
gene knockin techniques
clustered regularly interspaced short palindromic repeats
CRISPR associated proteins
hematopoietic differentiation
分类号
R346 [医药卫生—基础医学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位
李丹妮
刘云鹏
《中国医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
0
下载PDF
职称材料
2
GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探
李霞
李晓红
周涯
马峰
张勇刚
《生命的化学》
CAS
2023
0
原文传递
已选择
0
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引证文献
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