胆囊癌细胞株GBC-SD类肿瘤干细胞筛选的研究

目的 筛选胆囊癌GBC-SD系中具有干细胞特性的细胞克隆.方法 在肿瘤干细胞培养基加入不同剂量的顺铂悬浮培养GBC-SD,将悬浮细胞收集后注射裸鼠,并持续瘤内注射顺铂,成瘤后取瘤内细胞继续原培养基培养,获得悬浮生长的克隆,分别测定其干细胞标志物（CD133、CD44、CD24）、耐药基因ABCG2细胞株MDR-1和转录因子OCT-4、Nanog的表达.结果 在肿瘤干细胞培养基和顺铂的筛选压力下,GBC-SD细胞能有效形成悬浮生长的克隆球,流式检测结果表明克隆球高表达CD133＋（97.6%）、CD44＋（77.9%）,低表达CD24＋（2.3%）,同时表达耐药基因ABCG2和MDR-1,定量聚合酶链反应（PCR）及免疫荧光方法检测发现,与普通胆囊癌细胞株GBC-SD比较,克隆球干细胞基因OCT-4、Nanog表达分别增强266、284倍.结论 顺铂结合无血清培养基悬浮培养法筛选GBC-SD,作为一种新的干细胞分选方法,可以分离出具有肿瘤千细胞特征的胆囊癌克隆球.

组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌干细胞的影响

目的探索组蛋白去甲基化酶JMJD3对乳腺癌干细胞（BCSCs）的影响。方法采用改良后的无血清悬浮培养肿瘤干细胞的方法从乳腺癌MCF-7细胞系中分离扩增BCSCs;通过流式侧群细胞分选和免疫缺陷裸鼠腋下接种的方法检测BCSCs的生物学特性和致瘤性。采用Western Blot研究MCF-7及BCSCs中JMJD3表达的差异;采用CCK-8法检测JMJD3促进剂U0126及抑制剂GSK-J1对MCF-7增殖的影响;通过流式细胞侧群分选,检测GSK-J1、U0126对MCF-7中BCSCs比例的影响;采用Western Blot法研究GSK-J1、U0126对BCSCs中JMJD3蛋白表达的影响。结果改良后的无血清悬浮培养方法可成功地从MCF-7细胞系中分离并富集BCSCs;与MCF-7比较,BCSCs呈现出高致瘤性、JMJD3蛋白低表达性;U0126可抑制MCF-7的增殖,并降低MCF-7中BCSCs的比例,促进BCSCs中JMJD3的表达,而GSK-J1则呈现出相反的作用。结论JMJD3可抑制乳腺癌细胞的增殖,这种抑制作用可能与减少MCF-7中干细胞的比例有关。

人骨肉瘤细胞株HMG63肿瘤干细胞筛选与鉴定

目的建立1种分离人骨肉瘤细株HMG63肿瘤干细胞新模型。方法采用无血清干细胞培养基对人骨肉瘤HMG63瘤细浮培养形成细胞球，并予阿霉素耐药处理，把耐药细胞株注入裸鼠体内致瘤，致瘤成功后，在瘤体内注射化疗药顺铂，这样使得骨肉瘤肿瘤干细胞在增殖分化的同时反复富集后，提取细胞培养筛选，这样可获得骨肉瘤干细胞和其亚型。采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组织化学、流式细胞仪等鉴定。结果在无血清肿瘤干细胞培养基中，人HMG63细胞能有效形成悬浮生长的克隆球，流式检测结果表明克隆球低表达CD24（14％），高表达CD133（99％），同时高表达干细胞标志物Oct-4、Nanog等。结论通过无血清悬浮球培养结合抗肿瘤耐药筛选，可以从HMG63细胞中分离出具有干细胞特征的HMG63细胞克隆。

结肠癌细胞球高耐药性及其相关蛋白RAD51和BRCA1的表达

目的:探讨结肠癌HCT116和SW480细胞球的高耐药性与同源重组中心分子RAD51和人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene1,BRCA1)表达的关系。方法:通过无血清悬浮培养获得结肠癌HCT116和SW480细胞球,应用FCM法检测HCT116和SW480细胞球及单层细胞中肿瘤干细胞标志物CD133+细胞的含量。不同浓度的5-氟尿嘧啶(5-luorouracil,5-Fu)和奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)单独或联合干预HCT116和SW480细胞球和单层细胞后,采用CCK-8法检测细胞的增殖并计算各药物的半数抑制浓度(halfinhibitory concentration,IC50),FCM法检测细胞的凋亡率,免疫荧光及蛋白质印迹法检测细胞中RAD51和BRCA1的表达。结果:HCT116和SW480细胞在含生长因子的无血清培养液中形成可稳定传代的肿瘤细胞球,并且细胞球中CD133+细胞含量显著高于单层细胞(P<0.01)。相同浓度药物干预后,肿瘤细胞球与单层细胞相比细胞生存率更高而凋亡率更低,各药物作用HCT116和SW480细胞球的IC50值显著高于单层细胞(P均<0.01)。不同化疗药物干预后,HCT116和SW480细胞球及单层细胞中RAD51和BRCA1的表达水平均上调;相同药物干预后,HCT116和SW480细胞球中RAD51和BRCA1的表达水平均高于单层细胞(P<0.05)。结论:结肠癌HCT116和SW480细胞球耐药性明显高于普通单层细胞,RAD51和BRCA1可能参与了结肠癌细胞球的高耐药性。